蛍光を用いて藻体で中性脂肪を測定するための簡単かつ迅速なプロトコル
Summary
ナイルレッド染色手順を使用して藻の中性脂質含有量を決定するための簡単なプロトコルが記載されている。この時間節約の技術は、従来の重量ベースの脂質定量化プロトコルに代わるものを提供しています。これは、バイオプロセスの性能を監視する特定の用途のために設計されている。
Abstract
藻類は、彼らの自然な脂質貯蔵能力による再生可能な燃料源のための優れた候補と考えられている。藻類発酵プロセスと新しいオイルが豊富な株をスクリーニングするための堅牢なモニタリングは、細胞内の脂質含有量の測定のための高速かつ信頼性の高いプロトコルが必要です。現在の慣行は、油含有量を決定するために、重量法に大きく、時間がかかり、大量の試料を必要とする数十年前に開発された技術に頼る。本稿では、ナイルレッド、多数のタイプの生物における脂質体の存在を同定するために使用されている蛍光色素は、緑色、Auxenochlorellaのprotothecoidesの中性脂質含量を測定するための、簡単、迅速、かつ信頼性の高いプロトコルに組み込まれている藻類。この方法は、染色前に細胞膜と蛍光強度測定中に試料容量を増加させる96ウェルマイクロプレートを透過性にするために、エタノール、比較的穏やかな溶媒を使用する。それがデザインされているバイオプロセスのパフォーマンスを監視する特定のアプリケーションに編成長している培養物から、以前に乾燥されたサンプルやライブのサンプルをアッセイに使用することができます。
Introduction
による一定のストレス条件下で脂質体を格納するためのそれらの能力のために、藻類は、潜在的な再生可能な燃料源1,2として近年注目を集めている。中性脂質は、適切な成長条件3の下で細胞乾燥重量の60％以上を占めることができます。しかし業界では、適切にバイオプロセスのパフォーマンスを監視するために、藻類の細胞の脂質含有量を定量文化を分析し、新しい株をスクリーニングするために、シンプルなきれいな、迅速で、信頼性の高い標準化されたプロトコルを持っていません。
ブライ·ダイアー重量法は、いくつかの50年前に開発、現在4,5使用される最も一般的な技術の中に残っている。この手順は、単純で信頼性が高く、実施が容易であるが、それは時間がかかり、大量の試料を必要とし、有毒な溶媒を使用する。これは、発酵実行から多くのサンプルを分析したり、新しい油を多く含む株をスクリーニングするための実用的ではありません。他の方法は、bは有するEENを開発するが、通常は先進的な設備を必要とし、6を標準化されていない。
大きな関心を集めている選択肢は、ナイルレッド染色である。ナイルレッド、非極性環境で優先的蛍光を発する染料は、線虫7、8、酵母、細菌9、10-19および藻類を含む様々な生物における脂質体を同定または定量するために使用されている。ナイルレッドを含む初期の技術は、単一キュベット分光光度法、またはフローサイトメトリー染色を組み合わせて、主に定性的または半定量的であった。また、このような緑藻類などの藻類のいくつかのクラスは、技術10の範囲が制限されて染料に大部分が不透過性で厚い細胞井戸を持っている。
ナイルレッド染色法への最近の改善は、プロトコル10,11の初期の欠点をバイパスすることが報告されている。カーの存在下で細胞を染色するIERは、DMSOの10系溶媒またはエタノール10,11は、信頼性の高い定量的な測定を可能にし、油含有量と吸光度との関係を線形化する。溶媒は、ナイルレッド分子が通過できるように、細胞膜を透過性にするのに役立ちます。さらに、マイクロプレート読み取り機能を備えた分光光度計を組み込むこと定量分析に適した高スループットプロトコルを可能にする。
この記事の我々の詳細にエタノール、穏やかな溶媒の存在下でナイルレッドと文化を染色することにより、藻の油含有量を測定するための簡単な方法。最も正確にするために、測定におけるバックグラウンドノイズを考慮し、油含有量を蛍光強度を相関させる標準曲線は、既知油組成物の藻類細胞を用いて現像される。この方法は、以前公開されたプロトコル10,11から採用されている。 96ウェル分光光度計を使用することにより、時間の股関節内のサンプルと同じ量を分析することができるTは、重量法により監視するために何日もかかるでしょう。さらに、所望藻類種の代表的なサンプルを使用して校正することにより、このメソッドを直接解釈可能である比較的正確な測定値を生成します。異なる株およびアプリケーション向けに最適化されたナイルレッドで藻類を染色する方法を概説し、多くのプロトコルが存在する;ここで紹介するプロトコルは、もともとデラHOZまちがいなくらによって開発されました。Auxenochlorellaのprotothecoides、クロレラ·ブルガリス 、 セネデスムスのdimorphus、及びセネデスムス斜ための11を 、それがより多くの種やクラスのための可能性が適しているが。これは、監視、バイオプロセスのパフォーマンスの特定のアプリケーションで設計されており、それが成長している培養物から、以前に乾燥した試料と湿潤試料でも同様に動作します。
Protocol
Representative Results
Discussion
標準曲線に使用される藻類は測定されているものと同じ実験条件下で栽培し、同じ種でなければなりません。有意な培地組成の変化、栽培技術、および染色プロトコルが蛍光読み取りの強度に影響を与えることができる。 （セクション1および2に記載されている）ヘキサン抽出は、標準曲線に使用した試料の中性脂質含量を測定した。正確な蛍光強度測定のために、すべてのサンプルが同じ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、このプロジェクトのための財政支援を提供するための自然科学とカナダの工学研究評議会に感謝したいと思います。
Materials
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
- Chisti, Y. Biodiesel from microalgae. Biotechnol. Adv. 25, 294-306 (2007).
- . National Algal Biofuels Technology Roadmap. Energy Efficiency & Renewable Energy. U.S. Department of Energy, Office of Energy Efficiency and Renewable Energy, Biomass Program. , (2010).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Optimization of microalgal productivity using an adaptive, non-linear model based strategy. Bioresour. Technol. 104, 537-546 (2012).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem. Physiol. 37, 911-917 (1959).
- Hara, A., Radin, N. S. Lipid extraction of tissues with a low-toxicity solvent. Anal. Biochem. 90, 420-426 (1978).
- Han, Y., et al. Review of methods used for microalgal lipid-content analysis. Energ. Procedia. 12, 944-950 (2011).
- Pino, E. C., et al. Biochemical and high throughput microscopic assessment of fat mass in Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (73), (2013).
- Sitepu, I. R., et al. An improved high-throughput Nile red fluorescence assay for estimating intracellular lipids in a variety of yeast species. J. Microbiol. Meth. 91, 321-328 (2012).
- Izard, J., Limberger, R. J. Rapid screening method for quantitation of bacterial cell lipids from whole cells. J. Microbiol. Meth. 55, 411-418 (2003).
- Chen, W., et al. A high throughput Nile red method for quantitative measurement of neutral lipids in microalgae. J. Microbiol. Meth. 77, 41-47 (2009).
- de la Hoz Siegler, H., et al. Improving the reliability of fluorescence-based neutral lipid content measurements in microalgal cultures. Algal Res. 1, 176-184 (2012).
- de la Jara, A., et al. Flow cytometric determination of lipid content in a marine dinoflagellate, Crypthecodinium cohnii. J. Appl. Phycol. 15, 433-438 (2003).
- Elsey, D., et al. Fluorescent measurement of microalgal neutral lipids. J. Microbiol. Meth. 68, 639-642 (2007).
- Feng, G. -. D., et al. Evaluation of FT-IR and Nile Red methods for microalgal lipid characterization and biomass composition determination. Bioresour. Technol. 128, 107-112 (2013).
- Guzmán, H., et al. Estimate by means of flow cytometry of variation in composition of fatty acids from Tetraselmis suecica in response to culture conditions. Aquacult. Int. 18, 189-199 (2010).
- Huang, G. -. H., et al. Rapid screening method for lipid production in alga based on Nile red fluorescence. Biomass Bioenerg. 33, 1386-1392 (2009).
- Lee, S., et al. Rapid method for the determination of lipid from the green alga Botryococcus braunii. Biotechnol. Tech. 12, 553-556 (1998).
- Montero, M., et al. Isolation of high-lipid content strains of the marine microalga Tetraselmis suecica for biodiesel production by flow cytometry and single-cell sorting. J. Appl. Phycol. 23, 1053-1057 (2011).
- Vigeolas, H., et al. Isolation and partial characterization of mutants with elevated lipid content in Chlorella sorokiniana and Scenedesmus obliquus. J. Biotechnol. 162, 3-12 (2012).
- Bertozzini, E., et al. Application of the standard addition method for the absolute quantification of neutral lipids in microalgae using Nile red. J. Microbiol. Meth. 87, 17-23 (2011).
- Kou, Z., et al. Fluorescent measurement of lipid content in the model organism Chlamydomonas reinhardtii. J. Appl. Phycol. , 1-9 (2013).
