Un simple y protocolo Rapid para Medir lípidos neutros en las células de algas Utilizando Fluorescencia
Summary
Un protocolo simple para determinar el contenido de lípidos neutros de células de algas utilizando un procedimiento de tinción de Rojo Nilo se describe. Esta técnica de ahorro de tiempo ofrece una alternativa a los protocolos de cuantificación de lípidos basados en gravimétricos tradicionales. Ha sido diseñado para la aplicación específica de la supervisión del rendimiento de bioprocesos.
Abstract
Las algas son consideradas excelentes candidatos para las fuentes de combustibles renovables, debido a sus capacidades de almacenamiento de lípidos naturales. Monitoreo robusto de los procesos de fermentación de algas y la detección de nuevas cepas ricas en petróleo requiere un protocolo rápido y fiable para la determinación del contenido intracelular de lípidos. Prácticas actuales se basan en gran medida en los métodos gravimétricos para determinar el contenido de aceite, técnicas desarrolladas hace décadas que consumen mucho tiempo y requieren grandes volúmenes de muestra. En este papel, Rojo Nilo, un colorante fluorescente que se ha utilizado para identificar la presencia de cuerpos de lípidos en numerosos tipos de organismos, se incorpora en un protocolo simple, rápido y fiable para medir el contenido de lípidos neutros de protothecoides Auxenochlorella, un verde alga. El método utiliza etanol, un disolvente relativamente suave, para permeabilizar la membrana celular antes de la tinción y un pozo de micro-placa de 96 para aumentar la capacidad de la muestra durante las mediciones de intensidad de fluorescencia. Ha sido diseñadoedición con la aplicación específica de la supervisión del rendimiento bioprocesos. Muestras previamente secado o muestras vivos de un cultivo en crecimiento se pueden utilizar en el ensayo.
Introduction
Debido a su capacidad para almacenar cuerpos de lípidos bajo determinadas condiciones de estrés, las algas han recibido una gran atención en los últimos años como una potencial fuente de combustible renovable 1,2. Los lípidos neutros pueden representar más del 60% del peso seco de células bajo condiciones de crecimiento apropiadas 3. Sin embargo, la industria no tiene un protocolo estandarizado simple, limpia, rápida y fiable para cuantificar el contenido de lípidos de las células de algas con el fin de supervisar adecuadamente el desempeño de bioprocesos, analizar las culturas, y la pantalla de nuevas cepas.
El método gravimétrico Bligh-Dyer desarrolló hace unos 50 años sigue siendo una de las técnicas más comunes que se utilizan hoy en día 4,5. Mientras este procedimiento es simple, fiable, y fácil de llevar a cabo, que consume mucho tiempo, requiere grandes volúmenes de muestra, y hace uso de disolventes tóxicos. No es práctico para el análisis de muchas muestras de una operación de fermentación o el cribado de nuevas cepas ricos en petróleo. Otros métodos han been desarrollado, pero por lo general requiere de equipo avanzado y no se han estandarizado 6.
Una alternativa que ha ganado una gran cantidad de interés es la mancha del Nilo Rojo. Rojo Nilo, un tinte que emite fluorescencia preferentemente en entornos no polares, se ha utilizado para identificar o cuantificar cuerpos lipídicos en diversos organismos incluyendo nematodos 7, 8 de levadura, bacterias y algas 9, 10-19. Técnicas iniciales que implican Rojo Nilo eran en su mayoría cualitativa o semi-cuantitativa, la combinación de la mancha con espectrofotometría de una sola cubeta o citometría de flujo. Además, algunas clases de algas tales como algas verdes tienen pocillos de células gruesas que son en su mayoría impermeable al colorante, que limita la gama de la técnica 10.
Las recientes mejoras en el método de tinción de Rojo Nilo se ha informado de que pasar por alto las deficiencias iniciales del protocolo de 10,11. La tinción de las células en presencia de un CarrIER disolvente tal como DMSO o 10 10,11 etanol linealiza la relación entre el contenido de aceite y la absorbancia, lo que permite mediciones cuantitativas fiables. El disolvente ayuda a permeabilizar la membrana celular de modo que las moléculas de Rojo Nilo pueden pasar a través. Además, la incorporación de un espectrofotómetro con capacidades de lectura de micro-placa permite protocolos de alto rendimiento adecuadas para el análisis cuantitativo.
En este artículo se detallan un método simple para medir el contenido de aceite de las células de algas mediante la tinción con Rojo Nilo culturas en presencia de etanol, un disolvente suave. Con el fin de explicar con mayor precisión el ruido de fondo en las mediciones, una curva estándar de la correlación de la intensidad de fluorescencia para el contenido de aceite se desarrolla utilizando células de algas de composición de aceite conocida. El método es una adaptación de los protocolos publicados previamente 10,11. Mediante el uso de un espectrofotómetro de 96 pocillos, uno es capaz de analizar la misma cantidad de muestras en un tha horast tomaría días para controlar por métodos gravimétricos. Además, por la calibración con muestras representativas de las especies de algas deseada este método produce mediciones relativamente precisos que son directamente interpretables. Existen muchos protocolos de métodos de tinción de algas con Rojo Nilo optimizado para diferentes cepas y aplicaciones que describen; el protocolo que aquí se presenta fue desarrollado originalmente por de la Hoz Siegler et al. 11 para protothecoides Auxenochlorella, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus y Scenedesmus oblicuo, aunque es probable conveniente para muchas más especies y clases. Ha sido diseñado con la aplicación específica de la supervisión del rendimiento de bioprocesos y funciona igual de bien para muestras previamente secadas y muestras húmedas de una creciente cultura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las algas utilizado en la curva estándar debe ser de la misma especie de cultivo en las mismas condiciones experimentales como los que están siendo medidos. Los cambios significativos en la composición de los medios de comunicación, técnica de cultivo, y el protocolo de tinción pueden afectar a la intensidad de la lectura de fluorescencia. Extracción con hexano (descrito en las secciones 1 y 2) se utilizó para determinar el contenido de lípidos neutros de muestras utilizadas en la curva estándar. Para las medi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores desean agradecer a las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá para proporcionar apoyo financiero para este proyecto.
Materials
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
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