Eine einfache und schnelle Protokoll zur Messung neutralen Lipiden in Algenzellen mit Fluoreszenz
Summary
Ein einfaches Protokoll, um die neutrale Lipidgehalt der Algenzellen zu bestimmen, mit einer Nil-Rot-Färbung Verfahren beschrieben. Diese zeitsparende Technik bietet eine Alternative zu herkömmlichen gravimetrischen basierten Lipid Quantifizierung Protokolle. Es ist für die spezielle Anwendung der Überwachung Bioprozess Leistung ausgelegt.
Abstract
Algen gelten als ausgezeichnete Kandidaten für erneuerbare Energiequellen aufgrund ihrer natürlichen Lipidspeichermöglichkeiten. Robust Überwachung von Algenfermentationsprozesse und das Screening nach neuen ölreichen Stämme erfordert eine schnelle und zuverlässige Protokoll zur Bestimmung der intrazellulären Lipidgehalt. Aktuelle Praktiken beruhen weitgehend auf gravimetrische Methoden zur Ölgehalt zu bestimmen, entwickelten Techniken vor Jahrzehnten, die zeitaufwendig und erfordern große Probenvolumina. In diesem Papier wird Nile Red, ein Fluoreszenzfarbstoff, der verwendet wurde, um das Vorhandensein von Lipidkörper in zahlreichen Arten von Organismen zu identifizieren, in ein einfaches, schnelles und zuverlässiges Protokoll zum Messen der neutralen Lipidgehalt Auxenochlorella protothecoides, eine grün einge Alge. Die Methode verwendet Ethanol, ein relativ mildes Lösungsmittel, um die Zellmembran vor der Färbung und eine 96-Well-Mikroplatte, die Probenkapazität bei Messungen der Fluoreszenzintensität zu erhöhen permeabilisieren. Es ist Entwurfed mit der spezifischen Anwendung der Überwachungs Bioprozess-Leistung. Zuvor getrockneten Proben oder lebende Proben aus einer wachsenden Kultur kann in dem Assay verwendet werden.
Introduction
Aufgrund ihrer Fähigkeit, Lipidkörper unter bestimmten Stress-Bedingungen zu speichern, Algen haben eine große Aufmerksamkeit in den letzten Jahren als potenzielle erneuerbare Energiequelle 1,2 erhielt. Neutrale Lipide können über 60% des Trockengewichts der Zellen unter geeigneten Wachstumsbedingungen 3 entfallen. Doch die Industrie nicht eine einfache, saubere, schnelle und zuverlässige standardisiertes Protokoll zur Lipidgehalt der Algenzellen, um Bioprozess-Performance-Bildschirm für neue Stämme angemessen überwachen, Kulturen zu analysieren und zu quantifizieren.
Die Bligh-Dyer gravimetrischen Methode entwickelt, vor rund 50 Jahren noch zu den häufigsten Techniken heute 4,5 verwendet. Während dieses Verfahren ist einfach, zuverlässig und einfach durchzuführen, ist es zeitraubend, erfordert große Probenvolumina, und macht Gebrauch von toxischen Lösemitteln. Es ist nicht praktisch für die Analyse von vielen Proben aus einer Fermentationslauf oder die Selektion von neuen ölreichen Stämme. Andere Verfahren haben been entwickelt, aber in der Regel verlangen, moderne Ausrüstung und wurden nicht standardisiert 6.
Eine Alternative, die ein großes Interesse erregt hat ist der Nil Rote Fleck. Nile Red, ein Farbstoff, bevorzugt in unpolaren Umgebungen fluoresziert, wurde verwendet, um in verschiedenen Organismen einschließlich Nematoden 7, 8 Hefe-, Bakterien-9, 10-19 und Algen zu identifizieren oder zu quantifizieren Lipidkörper. Erste Techniken mit Nile Red waren meist qualitative oder semi-quantitative, die Kombination der Fleck mit Single-Küvette Spektrophotometrie oder Durchflusszytometrie. Darüber hinaus sind einige Klassen von Algen wie Grünalgen haben dicke Zell Brunnen, die meist undurchlässig für den Farbstoff, der den Bereich der Technik 10 begrenzt sind.
Die jüngsten Verbesserungen an den Nil Rot-Färbung wurde berichtet, dass die anfängliche Mängel des Protokolls 10,11 umgehen. Färbung der Zellen in der Gegenwart einer Carrier Lösungsmittel wie DMSO oder Ethanol 10 10,11 linearisiert die Beziehung zwischen Ölgehalt und Absorption, so dass für eine zuverlässige quantitative Messungen. Das Lösungsmittel hilft permeabilisieren die Zellmembran, so dass die Nile Red-Moleküle passieren können. Darüber hinaus, mit einem Spektralphotometer mit Mikro-Platte Lesefähigkeiten ermöglicht Hochdurchsatz-Protokolle geeignet für die quantitative Analyse.
In diesem Artikel werden wir ausführlich eine einfache Methode zur Messung der Ölgehalt der Algenzellen durch Färbung mit Nile Red Kulturen in Gegenwart von Ethanol, einem milden Lösungsmittel. Um möglichst genau entfallen Hintergrundrauschen in den Messungen wird eine Standardkurve korreliert Fluoreszenzintensität auf Ölgehalt Algenzellen mittels bekannter Ölzusammensetzung entwickelt. Das Verfahren wird von zuvor veröffentlichten Protokolle 10,11 angepasst. Durch die Verwendung eines 96-Well-Spektrophotometer, ist man in der Lage, die gleiche Menge von Proben in einer Stunde tha analysierent würde Tage dauern, um durch gravimetrische Methoden überwachen. Weiterhin wird durch die Kalibrierung mit repräsentativen Stichproben des gewünschten Algenarten erzeugt dieses Verfahren relativ genaue Messungen, die direkt interpretierbar sind. Es gibt viele Protokolle skizziert Methoden der Färbung Algen mit Nil-Rot für unterschiedliche Belastungen und Anwendungen optimiert; Die hier vorgestellten Protokoll wurde ursprünglich von de la Hoz Siegler et al. 11 Auxenochlorella protothecoides entwickelt, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus und Scenedesmus obliquus, obwohl es wahrscheinlich ist geeignet für viele Arten und Klassen. Es wurde mit der spezifischen Anwendung der Überwachungs Bioprozess Leistung konzipiert und funktioniert gleichermaßen gut für Proben zuvor getrocknet und nassen Proben von einer wachsenden Kultur.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die in der Standardkurve verwendet Algen müssen die gleichen Spezies unter den gleichen Versuchsbedingungen wie die gemessenen kultiviert werden. Wesentliche Veränderungen in der Medien Zusammensetzung, Anbautechnik und Färbungsprotokoll können die Intensität des Fluoreszenzlese beeinflussen. Extraktion in Hexan (in den Abschnitten 1 und 2 beschrieben) wurde verwendet, um die neutrale Lipidgehalt der Proben in der Standardkurve verwendet wird zu bestimmen. Für genaue Messungen der Fluoreszenzintensität, müssen a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada für die finanzielle Unterstützung für dieses Projekt bedanken.
Materials
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
References
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