Summary
Kombinatoriske 5 fluorescerende proteiner merking av blodkreft stamceller og stamceller tillater in vivo klonal sporing via confocal og to-foton mikroskopi, og gir innsikt i benmargen blodkreft arkitektur under regenereringen. Denne metoden gjør det mulig for ikke-invasiv skjebne kartlegging av spektralt-kodet HSPCs-avledet celler i intakt vev for omfattende tidsrom etter transplantasjonen.
Abstract
Vi utviklet og validert et fluorescerende merking metodikk for klonal sporing av blodkreft stamceller og stamceller (HSPCs) med høy romlig og tidsmessig oppløsning for å studere in vivo hematopoiesis bruker murine benmargstransplantasjon eksperimentell modell. Genetisk kombi merking ved hjelp lentiviral vektorer som koder fluorescerende proteiner (FPS) aktivert celle skjebne kartlegging gjennom avansert mikroskopi bildebehandling. Vektorer som koder fem forskjellige fps: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, og mCherry ble brukt til samtidig transduce HSPCs, og skaper en variert palett av farge merket celler. Avbilding ved hjelp av konfokal / to-foton hybrid mikros muliggjør samtidig høyoppløselig vurdering av unikt merkede celler og deres avkom i forbindelse med strukturelle komponenter i vevene. Volumetrisk analyse over store områder viser at spektralt kodet HSPC-avledede celler kan påvises ikke-invasiv måte i forskjellige intakt vev, inkludert benmarg (BM), For omfattende tidsrom etter transplantasjonen. Live-studier som kombinerer video-rate multiphoton og konfokalmikroskoper time-lapse bildebehandling i 4D demonstrere muligheten for dynamisk cellulære og klonal sporing på en kvantitativ måte.
Introduction
Produksjonen av blodlegemer, betegnet hematopoiesis, opprettholdes ved en liten populasjon av hematopoietiske stamceller og progenitor celler (HSPCs). Disse cellene befinner seg i benmarg (BM) i en kompleks microenvironmental nisje som består av osteoblaster, stromale celler, fettvev og vaskulære strukturer, alt implisert i kontrollen av selvfornyelse og differensiering 1,2. Som intakt BM har vært tradisjonelt utilgjengelige for direkte observasjoner, samspillet mellom HSPC og deres mikromiljøet er fortsatt i stor grad uncharacterized in vivo. Tidligere har vi etablert en metode for å visualisere 3D-arkitekturen intakt BM bruker confocal fluorescens og refleksjon mikros tre. Vi karakterisert utvidelse av EGFP-merkede HSPCs i BM, men bruk av bare et enkelt FP utelukket analyse av regenerering ved et klonal nivå. Veldig nylig vi tok fordel av Lentiviral Gene ontologi (Lego) vektorer konstitutivt uttrykker FLuorescent proteiner (FPS) til effektivt markere celler 4,5. Co-transduksjon av HSPC med 3 eller 5 vektorer genererer en mangfoldig palett av kombinatoriske farger, slik at for sporing av flere individuelle HSPC kloner.
Merket HSPC kombinert med ny bildeteknologi lov til å spore individuelle HSPC homing og engraftment i BM av bestrålte mus. Lego vektorer ble brukt til å markere HSPC med 3 eller 5 forskjellige fps (fra Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, og mCherry) og følger deres engraftment over tid i BM av confocal og 2-foton mikroskopi, slik at klare visualisering av bein og annet matrisestrukturer, og forholdet av HSPC kloner til komponenter av deres mikromiljø. HSPC ble renset som avstamning negative celler fra C57BL / 6 mus BM, transduced med Lego vektorer, og re-infuseres ved halevenen injeksjon i myelo-ablateres congenic mus. Ved å overvåke store volumer av sternum BM vev vi visualisert endosteal innpodingen fore tidligBM gjenfødelse. Celle klynger med variert farge spektra viste seg innledningsvis i nær tilknytning til benet og kommet midt over tid. Interessant, etter mer enn tre uker margen besto av makroskopiske clonal klynger, noe som tyder på spredning av hematopoiesis avledet fra enkelt HSPCs contiguously i margen, i stedet for stor utbredelse av HSPCs via blodet. Det var mindre farge mangfold på sene tidspunkter, noe som tyder på problemer med transducing langsiktig repopulating celler med flere vektorer.
I tillegg dannet HSPCs klynger i milten, et organ også ansvarlig for hematopoiesis hos mus. HPSC-avledet individuelle celler kan løses i thymus, lymfeknuter, milt, lever, lunge, hjerte, hud, skjelettmuskulatur, fettvev og nyre i tillegg. 3D-bilder kan vurderes kvalitativt og kvantitativt å sette pris på distribusjon av celler med minimale forstyrrelser av vev. Til slutt, vi illustrered gjennomførbarheten av levende dynamiske studier i 4D ved å kombinere resonans skanning multiphoton og konfokalmikroskoper time-lapse imaging. Denne metodikken gjør non-invasiv høy oppløsning, flerdimensjonal celle-skjebne sporing av spektralt merkede celler bestander i sine intakt 3D arkitektur, som gir et kraftig verktøy i studiet av vev gjenfødelse og patologi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle mus ble plassert og håndtert i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health, og innmeldt i en NHLBI Animal Care og bruk komité-godkjent protokollen. Kvinne B6.SJL-Ptprc (d) Pep3 (b) / BoyJ (B6.SJL) og C57BL / 6 mus, 6-12 uker gamle, ble brukt som donor og mottaker, henholdsvis.
En liste av materialer, reagenser og utstyr er angitt i tabell 1.
1. Lego transduksjon av Mouse HSPCs og benmargstransplantasjon
Utfør prosedyrene som er beskrevet nedenfor i en sertifisert biosikkerhet nivå 2 (BSL-2) skap (vev kultur hette).
- Produksjon av Lego Vectors Encoding 5 fps
- Bruk lentiviral "Gene ontologi" (Lego) vektorplasmider, hver koding en annen FP fra en sterk konstituerende SFFV arrangøren, inkludert Lego-Cer2 (Cerulean), Lego-G2 (EGFP), Lego-V2 (Venus), Lego-T2 (tdTomato), og Lego-C2 (mCherry) vennlig levert av Dr. Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Tyskland); nå også tilgjengelig fra Addgene 5-7.
- For å produsere Lego vektorer, frø 5 x 10 6 293T-celler i 10 cm skåler (bruke 12 retter for hver vektor) 24 timer før transfeksjon i 8 ml I10 medium (IMDM supplert med 10% FCS og glutamin / penicillin / streptomycin).
- Transfektere cellene med kalsiumfosfat bruker litt forandrede CAPHOS kit anbefalinger:
- For hver plate mix 15 mikrogram lego vektor, 12 mikrogram pCDNA3.HIVgag / pol.4xCTE, 4 mikrogram Forrige-TAT, og en mikrogram pMD2.G-VSV-G plasmider i nærvær av 50 mL 2,5 M CaCl 2, og tilsett vann til gi en 500 pl totalt volum.
- Bunnfall DNA-plasmider med 500 ul av 2 x HeBS (HEPES-bufret saltoppløsning) og inkuber i 20 min ved romtemperatur før tilsetning til hver plate av 293T-celler.
- Inkuber cellene for6 timer i en 37 ° C 5% CO2 inkubator; fjerne media og legge frisk kultur media 6 hr innlegg transfeksjon.
- Samle kultur-supernatanter inneholdende lentiviral partikler fra hver plate, hver dag, i 3 dager. Hver dag etter supernatant samling legge fersk I10 media til hver plate.
- Filtrer gjennom 0,22 um porer, basseng og konsentrere supernatanten etter ultrasentrifugering på en SW28 rotor i 2 timer ved 71 900 xg og 4 ° C.
- Resuspender supernatantene i 1 ml av StemSpan medier. Delmengde de lentiviral bestander i 200 mL og oppbevar ved -80 ° C.
- Titrering av Lentiviral Partikler
Bestem titer av Lego vektor partikler i innsamlede Supernatantene via kvantifisering av transducing enheter / ml ved hjelp NIH3T3 celler. Titere tillate beregning av volumet av hver vektor supernatant nødvendig for å resultere i den ønskede relative multiplisitet av infeksjon (MOI) på eksperimentell targetceller.- Plate 5 x 10 4 NIH3T3 celler per brønn (12-brønns plate) i 2 ml I10 medier dagen før titrering.
- Forbered 5-ganger serie-fortynninger av vektor supernatanter i I10 medier supplert med protamin-sulfat (4 mg / ml er 1,000x).
- Fjern materialet fra cellene, og erstatte med 500 mL av supernatant fortynninger som inneholder tilsvarende 2, 0,8, 0,32 og 0,128 mL konsentrert virus.
- Bestem antall (No) av celler tilstede per brønn ved transduksjon, teller en kontrollbrønn.
- 6 hr etter transduksjon, tilsett 2 ml I10 media og inkuberes i 3 dager ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Høste cellene fra hver brønn med Trypsin-EDTA, og bestemme prosentandelen av fluorescerende celler (% FP) via strømningscytometri.
- Beregn titer som følger, i snitt de titere oppnådd for hver brønn (fortynning) som resulterer i en FP mellom 1% og 50%: Titer (vektor partikler / ml) = Neix% FP / Volum av vektor supernatant (ml). Gjennomsnittlig de titere oppnådd for hver fortynning dersom% FP er mellom 1 og 50%.
- Mouse Cell Samling, rensing, Transduksjon, og transplantasjon (skjematisk vist i figur 1A tilpasset fra Malide et al. 4).
- Sacrifice donor mus av en godkjent prosedyre. Innhøsting benmarg fra fremre og bakre lemmene: dissekere humeri, lårben og tibias, fjerne grundig alle muskler, leddbånd og overflødig vev fra bein, kuttet tvers slutten av hvert bein så nært som mulig til felles, og skyll benmargen av benet ved hjelp av en 27-0 G nålen på en sprøyte inneholdende mediet I10.
- Pellet hele benmargceller i 10 min ved 500 x g, 4 ° C, og lyserer røde cellene to ganger med 50 ml buffer ACK. Suspender cellene i 10 ml I10 medier.
- Rens avstamning negative (karmene) stamceller med MACS avstamning uttømming kit i henhold til en modifisert kit-protokollenl:
- Bruk 30 ul av anti-Biotin mikroperler i stedet for 10 pl / 10 7 celler; fullvasketrinnene med I2 medium (IMDM supplert med 2% FCS) i stedet for buffer.
- Sett den ene vasketrinn mellom inkubasjon med Biotin-antistoff Cocktail og inkubasjon med Anti-Biotin mikroperler; og ekvilibrere kolonnen med I10 i stedet for buffer.
- Kultur karmene cellene i 48 timer ved en starttetthet på 5 x 10 5 celler / ml i StemSpan medier supplert med 10 ng / ml murin IL-3, 100 ng / ml murint IL-11, 100 ng / ml humant Flt-3 ligand og 50 ng / ml murin stamcellefaktor.
- Overføring 1 til 4 x 10 5 celler til 12-brønners plater belagt med RetroNectin og transduce med lego-supernatanter, hver ved en multiplisitet av infeksjon (MOI) på 6-7 for å oppnå 50% ekspresjon virkningsgrad for hver FP, i nærvær av StemSpan medier og cytokiner beskrevet ovenfor, og 4 ug / ml protaminsulfat.
- Transduce cellermed hver Lego vektor individuelt som beskrevet i trinn 1.3.5 og bland-celler etter transduksjon (betegnet Mix) eller co-transduce-celler med alle 5 Lego vektor supernatanter samtidig (betegnet Co). Fjern celler 24 timer senere, vaske en gang med StemSpan media uten cytokiner, og resuspender dem i StemSpan media uten cytokiner for transplantasjon, eller overføre dem til frisk media med cytokiner, og kultur for ytterligere 96 timer før konfokalmikroskopi og flowcytometri.
- Utfør benmargstransplantasjon ved infusjonen omformet karmene HSPCs via haleveneinjeksjon inn i 11 Gy enkeltdose pre-bestrålte mottakere (6-18 timer før transplantasjon) mottakere, i et volum på 100 pl, ved en celle dose per mus tilsvarende 1 -4 x 10 5 karmene celler opprinnelig belagt for transduksjon. I hvert eksperiment, transplantere hele kohort av dyrene med den samme populasjon av omformet donor BM-celler.
- For in vitro karakterisering av transduserte HPreparatomtaler, kultur cellene i ytterligere 4-5 dager i StemSpan supplert med cytokiner og analysere ved flowcytometri for transduksjon effektivitet, og ved mikroskopi for farge mangfold.
- Sacrifice individuelle mus og hente vev og organer for bildebehandling, på ulike tidspunkter opp til 120 dager etter transplantasjon.
- Spray med etanol pelsen av musen og langsgående snitt i huden på ventral side unngå hår formidling.
- Dissekere og avgiftsdirektoratet i henhold til standard prosedyrer milt, knehasecyste lymfeknuter, lunge, hjerte, hud, fettvev, skjelettmuskulatur, nyre, lever, samt hodet for å få tilgang til calvaria.
- Alternativt kan du bruke calvaria eller sette opp et bein vindu for direkte avbildning gjentatte ganger over tid 2,8,9 eller bilde overfladiske organer som hud og lymfeknuter i levende dyr.
- Plasser enkelte organer i 35 mm nummer 0 dekkglass kultur retter i 50-10056; l PBS for å avbilde dem intakt uten snitting, fiksering eller ytterligere behandling som beskrevet i trinn 2.5.
- For volumet imaging, holde organene i i kaldt PBS inntil bruk. For time-lapse bildebehandling fortsette umiddelbart til bildebehandlings organer i DMEM, 10% FBS inneholder 20 mm HEPES ved 37 ° C
- Sacrifice individuelle mus og hente vev og organer for bildebehandling, på ulike tidspunkter opp til 120 dager etter transplantasjon.
2. Confocal og To-foton mikroskopi og bildeanalyse
- Utfør mikros avbildning ved hjelp av en Leica SP5 fem kanaler confocal og multiphoton system utstyrt med multi-line Argon, diode 561 nm, HeNe 594 nm, og HeNe 633 nm synlige lasere. Bruk i 2-foton-modus, et pulserende femtosecond Ti: Sapphire (Ti-Sa) laser, tunable for eksitasjon fra 680 til 1080 nm med spredning korreksjon. Bruk i forsøk med rød-forskjøvet FPS (tdTomato og mCherry), en optisk parametrisk oscillator (OPO) laser for å utvide produksjonen bølgelengdeområde så langt som 1,030-1,300 nm, sekvensielt eller samtidig med tHan Ti-Sa laser.
- Bilde ulike vev ved hjelp av en HCX-IRAPO-L 25X / 0,95 NA vann dipping objektiv (WD = 2,5 mm), en HC-PLAPO-CS 20X / 0,70 NA tørr objektiv (WD = 0,6 mm), eller HC-PL-IRAPO 40X /1.1 NA vannimmersjonsobjektiv (WD = 0,6 mm).
- Skaff konfokale fluorescensspektra samle lambda stacks (xyλ) av lyset i fem NM-båndbredder av det synlige spekteret fra BM celler transduced med et enkelt FP Lego vektor så vel som av kontroll, ikke-transplanterte BM.
- Prosess bilder med Leica LAS-AF v2.4.1 programvare for å lage referanse spektra av alle 5 fps samt av autofluorescence (figur 2A). Ved hjelp av den individuelle FP-spektra og forskjellen i lysstyrke fluorescens (uttrykt som% av EGFP) av Sakura (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) og mCherry (47%) innstilt 5 sekvensielle billed kanaler som følger: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venus (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), og mCherry (594 / 618-670 nm) (
- Valider nøyaktig fps separasjon, så-celler transdusert med hver individuelle FP er synlige bare i den tilsvarende kanal og fraværende fra resten (figur 2C). I tillegg skaper dette definert flerkanals tilnærming en unik 5-kanaler "Color" som muliggjør etterfølgende fargeanalyse og klonal sporing og har fordelen av å redusere innhentingstider sammenlignet med spektral avbildning.
- Prosess bilder med Leica LAS-AF v2.4.1 programvare for å lage referanse spektra av alle 5 fps samt av autofluorescence (figur 2A). Ved hjelp av den individuelle FP-spektra og forskjellen i lysstyrke fluorescens (uttrykt som% av EGFP) av Sakura (79%), Venus (156%), tdTomato (283%) og mCherry (47%) innstilt 5 sekvensielle billed kanaler som følger: Cerulean (458 / 468-482 nm), EGFP (488 / 496-514 nm), Venus (514 / 523-558 nm), tdTomato (561 / 579-597 nm), og mCherry (594 / 618-670 nm) (
- Separat fluorescensemisjonen, i to-foton-modus, ved høy effektivitet tilpasset dikroiske speil og samles med fire kanaler ikke-descanned detektor (NDD) som følger: en dikroisk speil ved 568 nm, etterfulgt av et dikroisk speil ved 465 nm, etterfulgt av en 452/45 nm utslipp filter for SHG eller autofluorescence og Cerulean, en 525/40 nm utslipp filter for EGFP eller Venus, og en 648 nm dichroic speil og 620/60 nm utslipp filter for tdTomato eller mCherry.
- Avslør strukturell informasjon av to-foton mikroskopi intrinsic kontrastavbildning (som beskrevet ovenfor) av vev autofluorescens fra elastin, NADH, (spent ved 780 nm), og andre harmoniske generert signal (SHG) fra bein og fibrillær kollagen (spent ved 920 nm eller 860 nm samles i en tilbake-spredt retning) 10,11.
- For 3D volumgjengivelse, samle serie xyz-bilder (typisk 1 x 1 x 4 mikrometer 3 voksel størrelse) langs z-aksen ved 5 mikrometer intervaller over et område av dybder (150-300 um) i hele benmarg og andre vev, over store områder ved hjelp av flis funksjonen i programmet til å automatisk generere sydd volumer som omfatter en hel sternum fossae, ca 2,5 x 1,2 mm 2 (xy) og 300 mikrometer (z) (Tall 2D-2E) og Movie 1.
- Bilde calvarial marg direkte gjennom skallen uten seksjonering 2, 8.
- Seksjon sternum langs sagittalplanet (bisection) og derettertvers i skjøten mellom to sternal Fosse og bilde gjennom kutt ansiktet 3,4,12 (Oversikt i figur 1B tilpasset fra Takaku et al 3).
- For 4D time-lapse bildebehandling, plasserer fersk fjernet popliteal lymfeknute, milt, lunger, eller calvarial beinprøver uncut på 35 mm nummer 0 dekkglass kultur retter, i 50-100 mL DMEM, 10% FBS inneholder 20 mm HEPES ved 37 ° C og bruke to-foton Ti-Sa eksitasjon (860 nm) kombinert med confocal eksitasjon (458 nm, 488 nm, 514 nm, 561 nm, 594 nm) og Leica resonant scanner (8000 Hz / sek), tar z-stabler (~ 80 mikrometer) 20 sek intervaller i opp til 1 time.
- For samtidig tre farger 2P bildebruk Ti-Sa innstilt på 860 nm samtidig med OPO laser (innstilt på 1130 nm for tdTomato, eller 1140 nm mCherry) (Movie 2).
- Rekonstruksjon og analyse av 3D Volumer og 4D tidssekvenser
- Bruk Imaris x64 softwer versjon 7.6, eller alternative programvarepakker for å forvandle de flislagte-stabler av rå bilder til volum-rendret (3D) data fluorescerende celler inne benmargen og ulike vev og for å eksportere dem som 3D-rotasjons filmer, som tidligere beskrevet 3,4 (Movie 1) steg-for-steg eksempel:
- I Imaris, Åpne z-stack image; Velg "overgå" for å vise 3D-volum visualisering.
- Bruk "navigere" for å skru volumet rundt 360 °.
- Velg "Animasjon" for å lage en animasjon; bruke sentrale rammer for å legge utvalgte visninger, zoom, rotasjoner av volumet; Forhåndsvise filmen, redigere etter behov, og lagre filen i en ønsket filmformat (ex: avi, mov).
- For kvantitativ vurdering av 3D celle og klone frekvens, posisjoner, størrelser og distribusjon, videre prosess z-stabler ved hjelp Imaris XT moduler som integrerer MATLAB programmer som utfører avstandsmålerik- (ved hjelp av en avstand transformasjonsalgoritme) og klynger analyse, som tidligere beskrevet 3,4. Transform sekvenser av bildestakker over tid i volum-rendret fire-dimensjonale (4D) filmer med Imaris x64-programvare, og bruke spot og overflateanalyse for halvautomatiske sporing av cellemotilitet i tre dimensjoner ved hjelp av autoregressive bevegelses algoritmer.
- Utfør multispektral analyse av celler som følger: pakke ut multi-farge merket flekker ved å legge alle 5 kanaler gjennom kanalen aritmetiske av Imaris XT inn i en ny kanal; bestemme for alle flekker (celler) var den gjennomsnittlige intensitet fluorescens i hver av de 5 komponentkanaler. Eksportere verdiene i Excel programvare for å plotte grafer som viser den unike "Colorprint" dvs. den relative% av hver FP i enkelt celle (figur 2E graf). Korrigere datasettet for vev drift, og beregne celle hastighet og forskyvning over tid, spore lengder, stier, og avstander; eksportverdier i Excel software å plotte grafer. Monter sammensatte figurer med Adobe Photoshop CSS 5-programvaren.
- Bruk Imaris x64 softwer versjon 7.6, eller alternative programvarepakker for å forvandle de flislagte-stabler av rå bilder til volum-rendret (3D) data fluorescerende celler inne benmargen og ulike vev og for å eksportere dem som 3D-rotasjons filmer, som tidligere beskrevet 3,4 (Movie 1) steg-for-steg eksempel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hel-mount 3D confocal / 2-foton mikroskopi rekonstruksjoner av sternal benmarg tidsforløp avslørte engraftment og utvidelse av transplanterte co-5 fps i et mønster med bemerkelsesverdige egenskaper: kloner dukket klart avgrenset, homogent merket med bred palett av farger i utgangspunktet og fremgang over tid for å fortrinnsvis inneholder celler av hovedsakelig én farge. Konfokalmikroskopi oppsett og representative eksempler på bilde 5 fps-merket HSPC i sternal benmarg er illustrert i figur 2 og filmer en og to.
Hel-mount 3D confocal / 2-foton mikros rekonstruksjoner av intakte vev demonstrere muligheten til å spore skjebnen farge merket BM-avledet celler for lengre perioder i live vev. Representative eksempler på benmarg avledede celler i hematopoietiske og ikke-hematopoietiske organer etter transplantasjon er vist i Fi gur 3.
Figur 1. Oversikt over de eksperimentelle prosedyrer. A) skjematisk trinn illustrerer isolering av karmene BM celler, transduksjon med Lego vektorer som koder en rekke FPS fargevarianter, og reinfusjon av transduced celler inn-myelo-ablateres mus (benmargstransplantasjon). B) Benmarg (sternum, calvaria ), samt forskjellige organer / vev ble undersøkt ved konfokal og to-fotonmikroskopi på forskjellige tidspunkter etter transplantasjon. Panel A er adaptert fra figur 1 i Malide et al. Fire og Panel B adaptert fra figur 1 i Takaku et al 3.
2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figur 2. Konfokalmikroskopi oppsett og representativt eksempel for bildebehandling 5 fps-merket HSPC i benmargen. A) Spectral (xyλ) avbildning brukes til å registrere referanseutslippet spektra for hver FP, illustrert i normaliserte histogrammer pseudocolored med cyan (Cerulean), grønn (EGFP), gul (Venus), magenta (tdTomato) og rød (mCherry): spent ved 594 nm- (solid rød linje) sammenlignet med 561 nm- (stiplet rød linje) bølgelengde B) Fem kanaler som er satt til bilde sekvensielt utslipp av:. Cerulean (468-482 nm), EGFP (496-514 nm), Venus ( 523-558 nm), tdTomato (579-597 nm) og mCherry (618-670 nm). Panelene A og B er adaptert fra figur 1 i Malide et al. Fire C) Imaging of sternal BM fra mus transplantert med transduseres med individuelle FP-vektorer. Hver FP var synlig bare i celler transdusert med tilsvarende vektoren avbildet i riktig lmAnnel, og fraværende fra de andre (ingen cross-talk). D, E) engraftment og utvidelse av transplantert co-5FP markerte celler i benmargen in vivo. På dag 4 etter transplantasjon (D) klynger av celler som er merket i mange forskjellige farger var synlig nærhet til beinet kanten (SHG, hvit), fortrinnsvis plassert ved siden av skjøten mellom to fossae. Ved dag 30 (E) en stor klone av unik farge (grønn - gul) har utvidet til å okkupere hele fossae som illustrert i det fusjonerte så vel som enkeltkanaler bilder. FPS innholdsanalyse viser homogen merking av to FPS varianter EGFP og Venus.
Figur 3. Eksempler på benmarg avledet celler i blodkreft og ikke-hematopoetiske organer etter transplantasjon. Various tisSues og organer ble fotografert intakt gjennom dypet av 150-200 mikrometer og store flater, beregnings sydd og gjengis i 3D som skygge rekonstruksjoner. A) Popliteal lymfeknute på 120 dager etter transplantasjon demonstrerer spredte celler hovedsakelig merket med gult (Venus) og rød (mCherry) perifert omgitt av kollagenfibre (hvite, SHG). B) Tilsvarende, milten på samme tid, viser små klynger og hovedsakelig spredte celler av ulike farger sammenvevd av kollagenfibre nettverk. C) inn i leverceller med fluorescerende morfologi forenlig med stelceller eller makrofager (Kupffer celler) i ulike farger ble justert langs kollagenfibre nettverk (SHG hvit) opptegning lever lobular strukturer. d) I en hud klaff fotografert fra dermal side fluorescerende celler i ulike farger og morfologi ble sett, de fleste med stor størrelse og morfologi tyder Langerhans eller dendrittiske lignende identitet, LYIng henhold elastin fiber (autofluorescence på 780 nm, hvit) og langs kollagen (SHG på 920 nm, hvit) muskelfibre og hårsekkene. E) I hjertet sett fra epikardiell side en rekke individuelle store fluorescerende celler med makrofag-lignende morfologi opprinnelse fra flere kloner basert på de ulike fargene sett er synlige overfladisk og også ispedd dypere mellom cardiomyocytes (hvit) visualisert av deres iboende to-foton autofluorescence (ved 780 nm). Ingen FP fluorescerende kardiomyocytter ble observert. Nærliggende celler (CE) i samme farge foreslå in situ spredning og kort avstand migrasjon. F) I lungen mange fluorescerende celler med et mangfoldig palett av farger ble spredt over hele blondelignende strukturen av kollagenfibre (SHG) i det hele tatt dybde nivåer, med varierende morfologi tyder dendrittiske cellen, makrofager, og type 2 pneumocytt identiteter.
Movie 1. 3D rebygging av sternal BM på 4 dager etter transplantasjonen Co 5 fps. klynger av celler som er merket i mange forskjellige farger var synlige i umiddelbar nærhet til beinet kanten (SHG, hvit), fortrinnsvis plassert ved siden av skjøten mellom to fossae. Vennligst klikk her for å se denne filmen.
Movie 2. 4D tid forfalle sternal BM to-foton og OPO mikroskopi på dag 39 innlegg transplantasjon Co 3fps (Cerulean - hvit, Venus - gul, tdTomato - magenta) bein (SHG i hvitt). Merk flere statiske kloner merket med gult eller gul-magenta kombinasjon ved siden av bein i motsetning til svært bevegelige individuelle myeloide stamceller. Vennligst klikk her for å se denne filmen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver her detaljene i en kraftig metodikk nylig utviklet for klonal celle sporing, som kombinerer det store mangfoldet som genereres av kombinato merking med 5FP-koding Lego vektorer og bildebehandling med tandem confocal og 2-foton mikroskopi for å oppnå volumetrisk og dynamisk bildebehandling i levende vev. Dette utvidet bruk av FP-baserte fargemerking ved opptak confocal spektral identitet i 5 "distinkt" 8-bits kanaler. Dermed relative forholdet mellom Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato, mCherry innenfor hver celle skaper et unikt "Colorprint" for identifisering av klonal avkom. Den flerfarget merking av 5 fps øker etiketten palett med mer mangfold, som ble vist spesielt nyttig når du studerer distribusjon, kontakter, flislagte ordninger og konkurransedyktige samspill mellom celler eller grupper av celler av samme type i tette vevsprøver. Kombinert med to-foton eksitasjon av iboende strukturelle trekk ved ulike vev ogorganer, kan vi spore farge merket klonale cellene i sitt opprinnelige miljø uten behov for fiksering og fysisk snitting. Demonstrasjonen som datterceller fra individuelle stamfedre beholde en særegen "farge-print" til tross for differensiering og spredning ble vist i vår publisert studie, med hundrevis av differensierte celler som finnes i enkelte in vitro kolonier (CFU) viser den samme "Colorprint."
Denne tilnærmingen kombinerer fordelene med encellede løst oppløsning høyt sammen med optisk seksjonering via konfokalmikroskopi. Svært store x - y (mm 2) regioner av intakt tett vev volum kan undersøkes ved å generere flislagt-bilder. Disse bilder med høy oppløsning fra optiske seksjoner kan brukes til å rekonstruere beregnings (automatisk og "on-the-fly") fullstendig 3D-volumer av stor kompleksitet til dybder på ~ 30 mikrometer, omfattende ~ 20 til 30 lag av celler,vaskulær, ben og kollagenstrukturer. 3D rekonstruksjoner kan brukes til morfometriske ikke-invasive kvantitative analyser av biologisk interesse. En viktig påminnelse til påpeke er at store volum / oppløsning høy er tidkrevende, for eksempel 1 time per ~ 1 mm 3 av vev (en fossae av sternum), derfor anbefaler vi bildebehandling ikke mer enn en mus per eksperiment per dag når benmargen, så vel som forskjellige vev trenger å bli gjennomgått i detalj.
Selv om det er for øyeblikket teknisk umulig å avbilde sternal benmarg i samme mus gjentatte ganger over tid, kan verdifull informasjon fås ved å studere enkelte mus ved ulike tidspunkt fra en kohort opprinnelig transplantert med samme populasjon av Lego-transduced karmene celler. Sternum er et utmerket sted å studere benmarg regenerering på grunn av sin tidlig og komplett blodkreft rekonstituering, stabilitet, enkel seksjonering, reproduserbarhet, og stort volum. Det er viktig å nå nær 50% transduksjon effektiviteten av karmene celler for hver individuelle FP vektor Før man går videre med en transplantasjon og avbildnings eksperimentet, for å ha tilstrekkelig farge mangfold og FP-uttrykkende celler for å gjøre forsøket informativ. Det vil alltid være en forbeholdet at mer enn én klon kan ved en tilfeldighet ende opp med lignende eller identiske colorprints, særlig hvis transduksjon er ineffektive og mange celler har bare en eller to innsettinger. Det er også viktig å være sikker på at hver enkelt halevene-injeksjon leveres nær 100% av celle dose.
Dette beviser muligheten for høyoppløselig 4D leve dynamiske studier ved å kombinere resonans skanning multiphoton og konfokalmikroskoper time-lapse imaging. Det gjør at ikke bare statisk karakterisering av ulike kloner, men også analyse av kinetiske forskjeller mellom celler preget av samme farge. Videre viser video-rate 4D avbildning av tre FPS merkede prøver syssels successfully i tandem Tisa og OPO lasere for høyere effektivitet, mindre skadelig, dypere penetrasjon av levende vev, banet vei for 2-foton intra bildebehandling. I tillegg etablerer en verdifull mulighet til å spore celler over lengre perioder (måneder) overvinne dagens fargestoffbaserte begrensninger. Denne tilnærmingen bruker kommersielt tilgjengelige confocal og to-foton lasermikroskop og automatiserte bruker interaktiv bilde analysemetoder basert på en kommersielt tilgjengelig programvarepakke som gir enkel implementering i vanlig mikroskopi fasiliteter.
Endelig er denne metoden ikke begrenset til analyse av HSPCs. Mange biologiske systemer kan ha nytte av muligheten til å løse tid og rom arrangementer av clonally komplekse cellulære og strukturelle elementer via flerfarget merking og confocal og to-foton imaging. Organ gjenfødelse, immunreaksjoner, og tumor metastatisk mønstrene kunne avhørt, for å foreslå noen få potensielle bruksområder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Production of Viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22 µm) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse Cell Collection, Purification, Transduction, and Transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30 µm) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500 ml) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| Murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | 100 µg/ml is 1,000x |
| Recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | 100 µg/ml is 2,000x |
| Recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | 20 µg/ml is 2,000x |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | 100 µg/ml is 1,000x |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | Resuspend at 50 µg/ml |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | 4 µg/ml is 1,000x |
| Confocal and Two-photon Microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1 M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Coverslips 22 mm No 2 | Thomas Scientific | 6662-Q55 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1,080 nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1,030-1,350 nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25X/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20X/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40X/1.1 NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane | ||
References
- Lo Celso,, C,, Scadden, D. T. The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral 'gene ontology' (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso,, Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
