Generering av Published: October 31, 2014 doi: 10.3791/51934

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Jonathan James Caguiat¹

¹Department of Biological Sciences, Center for Applied Chemical Biology, Youngstown State University

Summary

Enterobacter sp. YSU vokser i glukose minimal salter medium. Auxotrophs er generert ved å transformere den med en transposome der tilfeldig setter seg inn i vertsgenomet. Mutanter blir funnet ved replika plating fra komplekst medium for å minimalmedium. Avbrutte gener er identifisert av genet redning og sekvensering.

Abstract

Prototrofe bakterier vokse på M-9-minimalsaltmedium supplert med glukose (M-9 medium), som brukes som en karbon- og energikilde. Auxotrophs kan genereres ved hjelp av en transposome. Den kommersielt tilgjengelige, Tn 5 avledede transposome anvendt i denne protokollen består av et lineært segment av DNA inneholdende et R6K γ replikasjonsorigo, et gen for kanamycinresistens og to mosaikk sekvens ender, som tjener som transposase bindingsseter. Den transposome, gitt som et DNA / transposase-proteinkomplekset, blir innført ved elektroporering inn i den prototrofe stamme, Enterobacter sp. YSU, og inkorporerer seg tilfeldig inn i denne vertens genom. Transformanter er replika-platet på Luria Bertani-agar plater inneholdende kanamycin (LB-gen) og på M-9 medium agar-plater inneholdende kanamycin (M-9-kan). De transformanter som vokser på LB-kan plater, men ikke på M-9-kan platene er ansett for å være auxotrophs. Renset genomiskDNA fra en auxotrof er delvis fordøyd, ligert og transformert til en pir ⁺ Escherichia coli (E. coli) belastning. Den R6Kγ replika tillater plasmidet å gjenskape i pir ⁺ E. coli-stammer, og kanamycin-resistensmarkør tillater valg plasmid. Hver transformant besitter et nytt plasmid inneholdende transposonet flankert av den avbrutte kromosomale regionen. Sanger-sekvensering og Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) foreslår en antatt identiteten til den avbrutte genet. Det er tre fordeler med å bruke denne transposome mutagenesis strategi. Først, betyr det ikke stole på uttrykk for en transposase gen av verten. For det andre er transposome innføres i målverten ved elektroporering, snarere enn ved konjugering eller ved transduksjon og derfor er mer effektivt. For det tredje gjør R6Kγ replika det enkelt å identifisere den muterte gene som er delvis gjenvunnet i et rekombinant plasmid. Denne teknikken kan brukes til å undersøke de gener som er involvert i andre egenskaper av Enterobacter sp. YSU eller over et bredere utvalg av bakteriestammer.

Introduction

Prototrofe bakterier vokse på M-9-minimalsaltmedium inneholdende glukose (M-9 medium), omdannelse av glukose gjennom sentrale karbon veier metabolisme for å generere forløpere, slik som aminosyrer, nukleinsyrer og vitaminer, for biosyntesen ^1. M-9 medium inneholder ammoniumklorid som en nitrogenkilde, og natrium-kaliumfosfat buffer og som en fosforkilde, magnesiumsulfat som en svovelkilde og glukose som karbon- og energikilde. Luria-Bertani (LB) medium er rike på aminosyrer fra trypton og i vitaminer og vekstfaktorer fra gjærekstrakt. Den støtter veksten av auxotrophs som ikke kan syntetisere aminosyrer, vitaminer og andre vekstfaktorer som kreves for vekst på M-9 medium. Således vil prototrofer vokse i LB og M-9 medium, mens auxotrophs vil vokse i LB-medium, men ikke i M-9 medium. Ved å introdusere mutasjoner i en prototrofe populasjon av bakterier og identifisere muterte gener som forårsaker auksotrofe fenotyper, er det possible å oppnå en bedre forståelse av metabolismen i en bakteriestamme.

Transposon-mutagenese kan brukes til å identifisere mange av de gener som er nødvendige for vekst på glukose i M-9 medium. Transposoner setter seg vilkårlig i vertsgenomet ^2. Ved å fange transposon transformanter på LB-agarplater og replika plating dem på M-9 medium agar-plater, er det mulig å screene for auxotrophs. Avbrutte gener er identifisert gjennom genet redning. Denne studien anvender et kommersielt tilgjengelig Tn 5-avledede transposome som leveres som en oppløsning av et lineært DNA-segment transposon blandet med transposase-proteinet. DNA-segmentet som mangler en transposase genet, men inneholder et gen for kanamycinresistens, en R6K γ replikeringsopphav og to mosaikk motiver som er DNA-sekvenser for transposase binding ved hver ende av segmentet ^3,4. Siden transposase-proteinet blir tilsatt direkte til DNA, DNA-segmentet aleneer definert som transposonet, og DNA / proteinkompleks transposase er definert som transposome. Den transposome omformes av elektroporering ^fem inn i en kanamycin sensitive vert (figur 1A). Kolonier som vokser på LB agar plater som inneholder kanamycin (LB-kan) har transposon innsatser (Figur 1b), og kopi belagt trans som ikke klarer å vokse på M-9 mediumagarplater inneholder kanamycin (M-9-kan) er auxotrophs (Figire 1C). Genomisk DNA fra en mutant er renset og delvis fordøyd med 4-basen skjære restriksjonsendonuklease, BFU CI (figur 1D). Den ligerte DNA ble transformert inn i en stamme av Escherichia coli (E. coli) som inneholder pir-genet (figur 1E). Dette gen tillater den nye plasmid inneholdende transposonet og flankerende vertens kromosomale region til å replikere i E. coli ^6. Kanamycinresistensgenet tjener som såelectable markør for det nye plasmidet. Til slutt, sekvensering ved anvendelse av primere komplementære til hver ende av transposonet og Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) ^7,8-analyse av den resulterende sekvensen blir brukt til å bestemme identiteten av de avbrutte gener.

Dette transposome mutagenese strategien gir tre fordeler ^tre. Først, siden den transposase-proteinet er bundet direkte til transposonet, betyr innsettingen avhenger ikke av ekspresjon av transposase genet i verten. Når transposonet inkorporerer seg inn i vertsgenomet, er transposase degradert, og hindrer ytterligere bevegelse av transposonet. Imidlertid kan ytterligere bevegelse ikke forebygges hvis verten besitter en endogen Tn 5 transpositional element. For det andre, gjør innføringen av transposome ved elektroporering det mulig å bruke den i en lang rekke verter. Det eliminerer også behovet for å innføre transposonet ved bakteriell eller ved konjugasjon VIral infeksjon. Begge prosesser krever verts mottakelighet. For det tredje gjør inkludering av kanamycinresistensgen og R6K γ replika i transposome det lettere å identifisere den avbrutte genet. Transposon-avbrutt regioner kan lagres og sekvensert som plasmider, eliminerer behovet for å bruke den inverse polymerase chain reaction (PCR) teknikk for genet identifikasjon.

Protokollen presentert i denne videoen beskriver hvert trinn for transposon mutagenese av Enterobacter sp. YSU ⁹ ved hjelp av en transposome fra dens innføring i de bakterielle celler til identifikasjonen av det antatte genet avbrutt. I tillegg til tidligere publiserte protokoller ^3,4,10, er detaljerte fremgangsmåter for bruk av replica plating for å screene for auxotrophs presentert. Denne teknikken mutagenese kan anvendes for å undersøke andre fenotyper, slik som antibiotika og metallmotstander, i forskjellige typer av bakterier, for identifying minimalt antall gener som kreves for vekst under definerte kulturforhold i syntetisk biologi studier, eller for å lære et laboratorium komponent av en genetikk eller mikrobiell fysiologi kurs.

Protocol

1. Electroporation av kompetente celler ^5,11

1. Fortynn en O / N LB kultur Enterobacter sp. YSU 1/20 i 50 ml frisk LB-medium og vokse med risting ved 120 rpm og 30 ° C til en OD (600 nm) mellom 0,4 og 0,6. Eventuelt, vokser andre bakteriestammer på sitt optimale veksttemperaturen.
2. Chill cellene på is i 5 minutter og sentrifuge ved 4 ° C og 7000 x g i 5 min.
3. Kast supernatanten, resuspender cellene i 50 ml steril iskald vann og sentrifuge ved 4 ° C og 7000 x g i 5 min. Gjenta dette trinnet.
4. Kast supernatanten og resuspender cellene i et volum på iskaldt vann lik cellepelleten volum. For langtidslagring, vask cellene med 10 ml iskald 10% (v / v) glycerol, resuspender pelleten i et like stort volum av iskald 10% (v / v) glyserol, lagre ved -80 ° C og tining på is før elektroporering.
5. Tilsett 0,5 mL av transposome til 40 ulceller. Den kommersielt tilgjengelige transposome oppløsningen blir tilført ved en DNA-konsentrasjon på 0,33 ug / ul. Selv 0,33 ug er anbefalt, er 0,165 ug DNA tilstrekkelig.
6. Plasser celle / transposome blandingen i en iskald, 0,2 mm, elektroporering kyvette og trykk på blandingen til bunnen av kyvetten. Sjokkere cellene ved 25 uF, 200 Ω, og 2,5 kV. For å sikre at cellene forblir kjølt, lagre electroporation kyvetter i en -20 ° C fryser før bruk.
7. Umiddelbart, tilsett 960 mL av filter steriliserte super optimal buljong med catabolitt undertrykkelse (SOC) medium. Bland ved å pipettere opp og ned og overføre cellene til en steril 1,5 ml mikrosentrifugerør.
   MERK: De cellene begynner å dø etter sjokket, men salt i SOC medium tillater dem å komme seg. For å økonomisere, er det ikke nødvendig å tilsette transposome eller til sjokk de negative kontrollceller. Bare legg 960 mikroliter sterilt SOC medium til det.
8. Inkuber cellene ved 30 ° C feller 45-60 min med risting ved 120 rpm. Dette gir tid for transposome å rekombinere med vertsgenomet og for cellene til å uttrykke kanamycinresistens.
9. Spre 100 ul av celler på en LB-kan agarplate og inkuber platen O / N ved 30 ° C. Oppbevar det gjenværende blanding transformasjon i kjøleskap ved 4 ° C. Spre ytterligere mengder på et senere tidspunkt opp til 2 uker etter den første elektroporering hvis nødvendig.

2. gridding av Trans

1. Tape et rutenett til lokket på en tom 100 x 15 mm petriskål. Kopier et rutenett fra "A Short Course i Bakteriell Genetics" ^12.
2. Tegn en linje på bunnen av en LB-kan agar plate. Bruke et lite stykke tape for å feste den til den gridded lokket, slik at gitteret er synlig gjennom agaren. Sørg for at linjen på bunnen av platen er på linje med toppen, midten av rutenettet. Forankring platen med tape holder det fra å skli, noe som åpner for enda gridding. Linjen letter koloni identifikasjon etter kopiplate.
3. Plukk en enkelt transformant med en steril tannpirker og øye på den i midten av en firkant i rutenettet. Bare trykk på kolonien og spot. Ikke grave tannpirker inn i agar. For å unngå forurensing av platen, håndtere tannpirker kun i den ene enden.
4. Spot en annen transformant i et tilstøtende torget som i trinn 2.3. Når platen er full, inkubere det O / N ved 30 ° C. Dette er master plate.

3. Replica Plating å Bestem auxotrof Fenotype ¹²

1. For hver plate som ble rutenett, lage en stabel med tre ferske agarskåler nummererte en gjennom tre: en for LB-kan, to for M-9-kan og tre for LB-kan. Tørk platene opp ned, O / N, ved 37 ° C før bruk.
2. Tegn en linje på toppen av hver plate som i trinn 2.2.
3. Tørk av kopiplate verktøyet med 70% etanol, plasser en steril bomullsfløyel firkant på toppen av kopiplate tilol og klemme fløyel torget ned. Hands er full av mikrober selv etter vask dem. Hindre innføring av forurensende mikrober ved håndtering av bomullsfløyel torget i kanten.
4. Rett linjen på master plate med en linje trukket på klemmen og plasser platen på toppen av bomullsfløyel torget. Bruke milde press for å overføre bakterier fra platen til bomullsfløyel torget. Vær forsiktig så du ikke å smøre bakterier. Fjern master plate fra bomullsfløyel torget.
5. Rett linje trukket på plate nummer én med linjen på klemmen og plassere den på toppen av bomullsfløyel torget. Bruke milde press for å overføre bakterier fra fløyel torget til plate. Fjern plate nummer én.
6. Kast fløyel torget i en beholder med vann og plassere en ren, steril bomullsfløyel firkant på replika plating verktøyet som i trinn 3.3. Dette trinnet forhindrer over-vaksinasjon som fører til gjennombrudd vekst og falske positive resultater.
7. Justerlinje på plate nummer én med linjen på klemmen og plassere den på toppen av den nye bomullsfløyel torget. Bruke milde press for å overføre bakterier fra plate nummer én til bomullsfløyel torget. Fjern plate nummer én.
8. Rett linje trukket på plate nummer to med linjen på klemmen og plassere den på toppen av bomullsfløyel torget. Bruke milde press for å overføre bakterier fra fløyel plassen til plate nummer to. Fjern plate nummer to.
9. Gjenta trinn 3.8 for plate nummer tre. Den tredje plate er en kontroll for fullstendig overføring fra hovedplaten til de to andre plater. Kast fløyel torget i en beholder med vann. Å gjenbruke velveteen torg, autoklaver begeret inneholder de forurensede velveteen torg, vaske dem, tørke dem, pakk dem inn i aluminiumsfolie og re-autoklav dem.
10. Inkuber platene ved 30 ° CO / N. Kolonier som vokser på begge LB-kan agarplater, men unnlater å vokse på M-9-kan platene er ansett å være (auxotrophs
11. Streak ut auxotrophs fra plate nummer en mot en frisk LB-kan agar plate, og inkuber platen ved 30 ° CO / N.
12. Streak ut for isolasjon tre kolonier fra strek plate i trinn 3.11 mot en frisk LB-kan plate. Inkuber platen ved 30 ° CO / N. Dette sikrer at mutanten er godt isolert. Dele tallerkenen inn i tredjedeler og strek ut hver koloni i en seksjon.
13. Spot kolonier fra stripete ut kolonier avledet fra trinn 3.12 på en frisk LB-kan-plate for å danne et nett som i trinn 2.1 til 2.4. Hver mutant blir re-testet i tre eksemplarer.
14. Replikere plate igjen som i trinn 03.01 til 03.10 for å bekrefte auxotrof fenotype.

4. Gene Rescue

1. Dyrk en 3 ml O / N-kultur av en isolert mutant koloni fra trinnet 3.13 i flytende LB-kan-medium ved 30 ° C. Rens genomisk DNA fra en ml kultur ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig genomisk DNA rensing kit.
2. Sett opp en blanding av 0,025 UBFU CI restriksjonsendonuklease og 14 ul av 1 ug / ul genomisk DNA i et 20 ul reaksjons på is. Siden BFU CI kutter transposonet på tolv forskjellige områder, kan det være mer effektivt å bruke restriksjonsendonuklease, BFA I eller Hae III, som kutter transposonet på to og tre forskjellige steder, henholdsvis.
3. Inkuber reaksjonsblandingen ved 37 ° C i 25 min og deretter ved 80 ° C i 20 min for å inaktivere enzymet. Analyser 3 pl av den delvis fordøyet DNA på en 0,8% agarosegel (figur 3). En vellykket partiell fordøyelse resulterer i en smøre fra over 10 kb ned til bunnen av gelen.
4. Ligere 15 ul delvis fordøyd genomisk DNA ved å bruke 800 enheter T4 DNA-ligase i en 500 ul reaksjon. Inkuber reaksjons O / N ved 4 ° C. Den store reaksjonsvolum maksimerer ligering av enkelt-fragmenter til seg selv og minimaliserer interaksjon mellom to eller flere DNA-fragmenter.
5. Utfeltte den ligerte DNA ved tilsetning av 50 ul 3 M natriumacetat, pH 5,5, og 1 ml 95% etanol og inkubering av det ved -20 ° C i 20 min.
6. DNA-mikrofuge ved 4 ° C og 13.500 x g i 10 minutter, vaskes pelleten med 70% etanol, tørker den i en vakuum-konsentrator sentrifugalkraft, og resuspender den i 10 ul nuklease fritt vann. Alternativt kan DNA bli lufttørket ved romtemperatur i 15 min.
7. Bruke 4 mL av resuspendert DNA til å transformere E. coli stamme ECD100D pir eller ECD100D pir116 av elektroporering som i pkt 1. R6k γ replika krever en bakteriestamme med en pir genet for å gjenskape ^seks. De pir belastningsskader resulterer i lave kopierings plasmider, og pir116 stamme inneholder en pir muterte genet som resulterer i høye kopi plasmider. Hver transformant inneholder et nytt plasmid med transposonet og et område av den avbrutte kromosom (figur 1E).
8. Inoculspiste 5 ml LB-kan medium med en enkelt koloni, vokser det O / N med risting ved 120 rpm og 37 ° C, og rense plasmid-DNA fra hele O / N kultur ved å bruke et kommersielt kit.
9. Fordøye 14 mL av plasmid med restriksjonsendonuklease Xho I. Kontroller at det endelige volum av reaksjonen er 20 pl. Dette enzymet gjenkjenner et område i midten av transposonet ved 5 'enden av kanamycin-resistensgenet. Analyser 10 ul av ufordøyd og spaltet plasmid på en 0,8% agarosegel (figur 3). Plasmidet består av 2 kb transposonet pluss flankerende DNA-vert.

5. DNA Sequencing

1. Sekvensere plasmidet ved å bruke et kommersielt tilgjengelig kit sekvensering, primere som er homologe til hver ende av transposonet, og en kapillar-sekvenseanalysesystem. Alternativt kan plasmidet bli sendt til en utvendig institusjon for sekvensering.
2. Bruk av molekylvektstandard (1 kb stige) igelen for å anslå størrelsen på plasmidet. Deretter anslå antallet nanogram (ng) av plasmid som er nødvendig for 50 fmol.
3. Måle konsentrasjonen av plasmid-DNA ved å bruke et spektrofotometer ved bølgelengder på 260 nm ₍₂₆₀ A) og 280 nm ₍₂₈₀ A). Kontroller at lysbanen lengde gjennom kyvetten er 1 cm. Bestemme konsentrasjonen ved å multiplisere absorbans ved 260 nm med 50 ng / mL. Høy kvalitet plasmid DNA vil ha en A ₂₆₀ / _{A-280-forhold} mellom 1,8 og 2,0.
4. Volumet av DNA som kreves for hver sekvenseringsreaksjon er antall ng nødvendig for 50 fmol dividert med konsentrasjonen av plasmidet. Bland volumet av nødvendig plasmid med vann for å bringe det totale volum opp til 10 ul.
5. Varm opp plasmid-DNA / vann-blanding ved 96 ° C i 1 min og deretter avkjøle det til romtemperatur.
6. Legg 8 ul masterblanding fra sekvenserings-settet og 2 ul av 1,6 uM av en av sekvenseringsprimere.
7. Follav protokollen fra sekvenseringssettet for det termosykler programmet og reaksjons opprydding.
8. Analyser hver prøve ved hjelp av en kapillær DNA analysesystem.
9. Bruk en kommersielt tilgjengelig programvarepakke for å vise DNA-sekvensen. Søk for sekvensen, "5'-GAGACAG-3 '", som er den siste 7 bp av transposonet (figur 4). Sekvensen før den 5 'ende av denne 7 bp-segmentet tilhører transposonet. Sekvensen etter 3'-enden av dette 7 bp-segmentet tilhører den avbrutte genet.
10. Bestem mulig funksjon av den avbrutte genet ved hjelp av Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) ^7,8. Bruk følgende link: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_PROGRAMS=megaBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch . Lim sekvensen av avbruddeted genet i tekstboksen, velg "andre" under databasen og klikk på "BLAST" nederst på siden. Når resultatet vises, bla nedover siden for å vise justerings resultater (figur 5).

Representative Results

Transformasjon av Enterobacter sp. YSU ved elektroporering med transposome genomet initieres tilfeldig innsetting i vertsgenomet (figur 1A, B). En vellykket elektroporering ga flere tusen transformanter som vokste på LB-kan platene. For å oppnå 300-400, godt adskilt kolonier per plate, ble mengden av transformasjonsblandingen spredt på hver LB agarplate-kan optimaliseres. Hver transformant inneholdt minst en transposon innsats, men det var ikke klart om et viktig gen for vekst på M-9 medium ble avbrutt uten screening av replica plating. Transformanter ble overført til frisk LB-kan plater i nett av 88 og kopi belagt på M-9 medium. Legg merke til, for å sikre at transposonet er opprettholdt i transformantene, Protokoller delen anbefaler tilsetning av kanamycin til M-9 medium platene. The M-9 medium ble supplementert med kanamycin ikke i dette tilfellet, men det var fremdeles mulig å oppnå auxotrophs uten. I (figur 1C). De andre 86 kolonier ikke har et avbrudd i et gen som er nødvendig for vekst på M-9-minimalmedium.

Noen kolonier kan ha blitt forurenset med tilstøtende kolonier under kopiplate. For å isolere en mutant som en ren kultur, ble det strøket ut fra LB-kan en plate nummer i trinn 3.1 på en frisk LB-kan agarskål og dyrket O / N ved 30 ° C. Tre kolonier som vokste ble strøket ut på en annen frisk LB-kan plate og dyrket O / N ved 30 ° C. Deretter ble en koloni som oppsto fra hver av de tre kolonier prikket inn på en tredje frisk LB-kan platen. Replica plating tilbake på en M-9 minimal medium plate verifisert in triplo den auxotrofe fenotype som ble observert i figur 2. Av de 1760 transposon transformantene screenes i en 2013 Microbial Physiology selvfølgelig, 23 var auxotrophs.

Den avbrutte genet fra en auxotrof ble deretter identifisert ved hjelp av genet redning. En auxotrof koloni fra den andre strekplate ovenfor (trinn 3.13) ble dyrket O / N i LB-kan medium, og genomisk DNA ble renset fra kulturen ved hjelp av et genomisk DNA-rensesett. Agarosegelelektroforese viste at det rensede DNA var større enn 10 kb i størrelse (figur 3, felt 2). For å bryte det genomiske DNA i mindre fragmenter som inneholdt transposonet og flankerende regioner (avbrutt verts Figur 1D), det ble delvis spaltet med 0,025 enheter av BFU CI i 25 minutter ved 37 ° C. Dette restriksjonsendonuklease kutt på 5'-GATC-3 'nettsider som oppstår omtrent hvert 200 til 500 basepar. Selv om derer tolv 5'-GATC-3 'steder innenfor transposonet, vil et stort antall fragmenter inneholdende det intakte transposonet og flankerende vertsgenomet fremdeles være til stede i den delvis fordøyet DNA. Felt 3 på fig 3 viser delvis fordøyd genomisk DNA med en flekk av DNA som begynner over 10 kb, hele veien til bunnen av gelen til under 0,5 kb. Dersom DNA-smear begynner under 2 kb, størrelsen av transposonet, og DNA ble fordøyd for mye. Det vil være nødvendig å redusere mengden av enzym som tilsettes, jo 37 ° C inkubasjonstid, eller begge deler. Hvis det ikke er bakvaske og kjørefelt med fordøyd DNA er det samme størrelse som DNA med ufordøyd DNA, så ingen fordøyelsen skjedde. Det vil være nødvendig å øke mengden av enzym som tilsettes, jo 37 ° C inkubering tid eller begge deler. Istedenfor å bruke BFU CI, kan det være mulig å bruke restriksjonsendonukleaser BFA I eller Hae III, som skjæres transposonet ved to og tre forskjellige områderhhv. Bruk av en av disse enzymer kan øke E. under genet redning coli pir ⁺ transformasjon yield.

Den delvis spaltede DNA ble ligert i en 500 ul reaksjon. Dette økte volum minimeres interaksjoner mellom andre DNA-fragmenter og maksimert sannsynligheten for at hvert fragment ligert med seg selv for å danne et sirkulært molekyl. Den ligerte DNA ble utfelt og transformert ved elektroporering inn i E. coli stamme ECD100D pir116. Transformasjonsblandingen ble spredt på LB-kan platene. Kolonier som vokste inneholdt et nytt plasmid som består av transposonet, og et område av den avbrutte vert-genet (figur 1E). Antallet kolonidannende enheter varierte fra 0 til 2000 per ml transformasjonsblanding. Hvis den flankerende kromosomale region kodet for et protein som var toksiske for E. coli-vert, transformasjonen effektivitet var lav eller bare et lite segment av kromnoen var assosiert med det nye plasmidet. Plasmid-DNA ble renset fra en kultur som ble podet med en enkelt transformant og spaltet med restriksjonsendonukleasen, Xhol, som gjenkjennes et enkelt område i sentrum av transposonet nær den 5 'ende av kanamycin-resistensgenet. Felt 4 i figur 3 inneholdt plasmidet og ufordøyd felt 5 inneholdt det fordøyde plasmid. Fordi renset plasmid DNA har en tendens til å bli supercoil, den vandret på en raskere hastighet enn samme tråd av lineære fordøyd DNA. Riktig størrelse på dette plasmid var 3 kb. Den inneholdt to kb av transposonet, pluss ca 1 kb av den avbrutte verts genet. Hvis den flankerende DNA verts inneholder en eller flere XhoI-gjenkjenningsseter, to eller flere plasmid band vil bli observert i kjørefelt med Xhol spaltet DNA.

Figur 4 viser en sekvenseringsresultatet for et plasmid som ble isolert fra en auxotrof. Etter å ha fjernet short transposon sekvens i fet skrift, ble verten DNA sekvensen innsendt for Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) analyse ^7,8. En av BLAST Resultatene antydet at den avbrutte sekvensen er lik en Enterobacter cloacae subsp. cloacae NCTC 9394 (EMB | FP929040.1 |) genet for chorismate glyceratmutase, som er involvert i biosyntesen av L-tyrosin og L-fenylalanin (figur 5) ^13. Noen ganger i løpet av ligering av det delvis fordøyet genomisk DNA, ligates den lineære transposonet til en eller flere andre BFU CI-fragmenter. Dette kan gjøre det BLAST resulterer forvirrende fordi identiteten til et gen endres brått. For eksempel, de første 41 basepar av en annen auxotrof avstemt til et gen for glutamat-5-semialdehyd dehydrogenase som er involvert i biosyntesen av ^en prolin. Deretter, de neste 219 basepar avstemt til et gen for et ribonukleosid-difosfat-reduktase-subenhet, etterfulgt av en 62 basepar-segment for lipid-A-disacc haride kinase. De siste 295 basepar segment tilpasset til glutamat-5-semialdehyd dehydrogenase nytt. Tilstedeværelsen av 5'-GATC-3 'seter for BFU CI foreslått at to mindre DNA-fragmenter ligert inn i plasmid reddet. Dermed gjør fortynning av delvis spaltet DNA for ligeringsreaksjoner ikke fullstendig eliminere bakgrunn forårsaket av ligeringen av mindre fragmenter. Fra disse resultatene ble det konkludert at transposome satt seg inn i genet for glutamat-5-semialdehyd dehydrogenase fordi sekvensen til dette genet var umiddelbart tilstøtende til transposonet. Andre auxotrophs inneholdt avbrudd i genet for beta cystathione lyase involvert i biosyntesen metionin; for histidinoldehydrogenase involvert i histidin biosyntesen; for fosfoserin fosfatase involvert i serin, glycin, cystein og biosyntese; og for ketol-syre reductoisomerase involvert i leucin, isoleucin og valin biosyntesen ^en.

nt "fo: keep-together.within-page =" always ">
Figur 1. Transposon Mutagenesis. (A) Bakterielle celler inneholdende et gen som er nødvendig for vekst på M-9-minimalsaltmedium inneholdende glukose. Den eske M-9 representerer en auxotrof gen. (B) Den transposome innføres i bakteriestammen ved elektroporering, og transposase-proteinet bundet til hver mosaikk ende (piler) setter tilfeldig transposonet inn i vertskromosomet ^3,4. Bare transposon transformanter inneholdende vil vokse på LB-kan mellomplatene. (C) Transformantene er replika sådd ut på M-9 medium inneholdende glukose og på LB-kan medium. Trans som ikke klarer å vokse (krysset ut) på M-9 medium inneholder glukose er auxotrophs. (D) Genomisk DNA er renset fra de auxotrophs og er delvis fordøyd med 4-basen cutteh, BFU CI, som gjenkjenner DNA-området, 5'-GATC-3 '. (E) Den delvis spaltet DNA blir behandlet med T4-DNA-ligase og transformert ved elektroporering inn i E. coli-stamme ECD100D pir for å danne et nytt plasmid som inneholder transposonet og den avbrutte kromosomale gen som er nødvendig for vekst på M-9 medium. Den pir-genet muliggjør sirkulære DNA-fragmenter som inneholder R6K γ replikasjonsopprinnelses i transposonet for å tjene som et replikasjonsopprinnelses i det nye plasmidet ^6. Kanamycinresistensgenet tjener som en selekterbar markør for det nye plasmidet. Plasmidet blir renset, og en ~ 500 bp sekvens av den avbrutte gen beregnes ved bruk primere (piler) som er homolog til hver ende av transposonet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. kopiplate. (A) Grid av trans som ble overført til en LB-kan agar plate. (B) Grid av de samme trans som ble overført til en M-9 middels plate. Auxotrophs vokste på LB-kan plater, men ikke på M-9 mellom plater. Disse er identifisert av de svarte firkantene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. 0,8% agarosegel Felt 1:. 1 kb stige. Felt 2: Ufordøyd genomisk DNA. Felt 3: BFU C I delvis fordøyd genomisk DNA. Felt 4: Ufordøyd reddet plasmid. Lane 5: Xhol fordøyd reddet plasmid.

Figur 4. Delvis DNA Sekvens av en Plasmid. Sekvensen i fet skrift er en del av transposonet og var ikke innlevert til BLAST analyse. Resten av sekvensen er et segment av de reddede gener fra verten.

Figur 5. BLAST Analyse ^7,8. Fra den første base (Query), vises det avbrutte genet til å kode en Enterobacter cloacae chorismate glyceratmutase, som er involvert i fenylalanin og tyrosin biosyntese.

Discussion

Transposon mutagenese ved hjelp av en transposome er et effektivt verktøy for å generere auxotrophs i Enterobacter sp. YSU og andre typer av Gram-negative og Gram-positive bakterier ^3,4. Prosessen ble initiert ved å innføre den Tn 5 avledede transposome i verten ved elektroporering. For å identifisere kolonier med innsatser, den utransformerte target-stamme måtte være følsomme overfor kanamycin for å selektere for den resistensmarkør som bæres av transposonet. Noen verter produserer restriksjonsendonukleaser som nedbrytes transposonet DNA før det kan rekombinere med vertsgenomet. Tilsetning av et restriksjonsendonuklease-inhibitor til elektroporering blanding kan minimalisere nedbrytning og å øke utbyttet transformasjon ^3. Mens fremstilling av electroporation kompetente bakterier, var det viktig å fjerne så mye salt som mulig for å hindre at en elektrisk lysbue eller gnist som dreper bakteriene som forårsakes ved nærvær av salt. Selv i fravær aven elektrisk lysbue, at cellene begynte å dø raskt etter sjokk dem. Legge til salt som inneholder SOC vekstmedium umiddelbart restaurert osmotisk balanse, minimert celledød og økt transformasjon effektivitet ^fem. Kanamycinresistente transformanter ble deretter flekket ut på en frisk LB-kan replika-plate og sådd ut på M-9 for å minimalt medium-agar. For å hindre over-vaksinasjon som kan føre til falske positive resultater som savner mulige auxotrophs ble velveteen firkanter slått på trinn 3.6 før resten av platene ble vaksinert. Deretter, i løpet kopiplate, ble akkurat nok press brukt til å overføre koloniene uten å forårsake smitte eller forurensning mellom tilstøtende kolonier.

Muterte gener i auxotrophs ble identifisert gjennom genet redning. Genomisk DNA fra hver auxotrof ble oppdelt ved å bruke en partiell fordøyelse med hyppig kutteren BFU-base-C spaltninger I. Delvise BFA I eller ved hjelp av Hae III, som kutter transposon sjeldnere, kan forbedre transposon transformasjon effektivitet. Det er også mulig å anvende en fullstendig spaltning med andre restriksjonsendonukleaser, 6-base og 8-base kuttere, som mangler steder innenfor transposonet. Spaltet DNA ble deretter ligert og transformert inn i E. coli stamme ECD100D pir eller ECD100D pir116 ^6. Selv om E. coli pir116 stamme ble transformert ved elektroporering i trinn 4.8, er det også mulig å anvende kjemisk kompetente celler. I dette tilfelle, bør hele transformasjonen bli spredt for å oppnå et stort utvalg av reddede plasmider. Den pir-genet gjør det mulig for sirkularisert transposonet å replikere som et lavt kopiantall plasmid, og pir116 muterte genet gjør at den kan replikere som et høyt kopi plasmid. Lave utbytter ved bruk av transformasjons pir116 stamme kan være på grunn av ekspresjon av toksiske genprodukter fra den opprinnelige verten. Toksisitet kan reduseres ved hjelp av lavt kopi pir belastningen gjøre sekvense mer utfordrende.

Genomisk sekvense ¹⁰ og PCR sekvense ¹⁴ finnes alternative metoder til genet redning. Den genomisk sekvenseringsmetode sekvenser flankerer kromosomregioner direkte fra renset genomisk DNA. Denne strategien er nyttig når genomet av den target organisme har allerede blitt sekvensert. Når det muterte regionen har blitt identifisert av genomisk sekvensering og BLAST, kan hele regionen bli forsterket av PCR og klonet for videre analyse. PCR-metoden benytter to PCR-reaksjoner og fire forskjellige primere. Den første reaksjonen parene et transposon homolog primer (primer 1) med en degenerert primer som inneholder en kort DNA, linkersekvens (primer 2). Den andre PCR-reaksjonen er en nestet PCR-reaksjon, sammenkobling et annet transposon homolog primer (primer 3) med en linkersekvens homolog primer (primer 4). Fylle nettstedet for primer 3 ersom ligger på 3'-siden av området for priming primer 1. Deretter blir amplicand fra andre PCR-reaksjonen renset og sekvensert. Denne automatiserte DNA-sekvenseringsmetode forsterker direkte fra de mutante celler, noe som eliminerer behovet for både genomisk DNA rensing og plasmid redning.

I stedet for å identifisere gener som er involvert i auxotrofi, transposon-mutagenese kan også anvendes for å studere andre lett analysert fenotyper. Enterobacter sp. YSU er en multi-metall-resistent bakteriestamme som også er motstandsdyktig 100 ug / ml ampicillin (upubliserte data). Dens minimal hemmende konsentrasjon (MIC) for HgCl _to er 70 mikrometer, _ZnCI2 er 800 mikrometer, Agno ₃ er 80 mikrometer og NaAsO ₂ er 14 mm ^9. Etter innføring av transposome inn i denne stamme og gridding transformanter på LB-kan plater, kan de gridded koloniene replika bli sådd ut på medium inneholdende metaller ved konsentrasjoner under MIC for denne bacterial belastning. Redningen og sekvensering av en avbrutt gen fra en mutant med en senket MIC kan avsløre et gen som gir resistens mot ett av disse metaller.

I tillegg til å generere mutanter, kan transposome bli brukt som en vektor in vitro eller in vivo for å identifisere gevinst på funksjons gener, for eksempel antibiotisk resistens eller metall. For in vitro-strategi, genomisk DNA fra Enterobacter sp. YSU blir spaltet med en restriksjonsendonuklease som gjenkjenner områder utenfor transposonet. DNA blir ligert og blandes med transposome i en buffer inneholdende Mg ^2+. Etter rekombinasjon mellom transposonet og tilfeldige genomiske fragmenter, E. coli-stamme pir ECD100D er transformert med DNA og spredd på skåler inneholdende ampicillin eller et metallsalt. Kolonier som vokser vil ha en ny plasmid som inneholder transposonet ligger ved siden av vertens motstands genet. For in vivo strategy, Enterobacter sp. YSU transformeres med transposome. Deretter blir hele reaksjons transformasjon dyrket i LB-kan flytende medium for å selektere for en stor populasjon med vilkårlige transposon innsatser. Genomisk DNA blir spaltet med en restriksjonsendonuklease som gjenkjenner områder utenfor transposome, ligert og transformert inn i E. coli-stamme ECD100D pir. Som i den in vitro-metode, er transformanter spredt på ampicillin eller metallplater. Igjen vil det resulterende plasmid består av transposonet innsatt ved siden av et resistensgen. Disse to strategier vil være vellykket bare dersom målet resistens-genet kan bli uttrykt og er aktiv i E. coli-stamme.

Transposon-mutagenese kan brukes til å identifisere den minimale antall gener krever en bakteriestamme for vekst ^15,16. To transposomes inneholder loxP områder og forskjellige antibiotika resistensmarkører er nødvendig for at denne strategien ina bakteriestamme med en kjent genomsekvens. Etter at de to transposoner integrere, uttrykt katalyserer en rekombinasjon ere rekombinase reaksjon mellom de to loxP-seter, noe som eliminerer kromosomale regioner mellom transposonet innsettinger. Kjennskap til genom-sekvens som gjør det mulig å identifisere hvilke gener er eliminert. Evnen til å vokse demonstrerer at de eliminerte gener som ikke er nødvendige for vekst. Denne teknikken er arbeidskrevende, og en minimal genom for vekst ved hjelp av denne strategien er ennå ikke avsluttet. Imidlertid beregnet en automatisert transposon mutagenese studier av Pseudomonas aeruginosa ved å bruke PCR-sekvense 300-400 gener som var nødvendige for vekst av denne bakterien i rikt medium ^14. Denne studien brukte ikke loxP / ere rekombinase system.

Mikrober med minimal genomer er nyttige for syntetisk biologi ^17. En bakteriestamme med minimal et genom er especially nyttig for å eliminere produksjon av uønskede biprodukter. For eksempel er Clostridium acetobutylicum (C. acetobutylicum) brukt til å produsere biobrensel, ¹⁸ butanol. Under sin vekst, frembringer denne stamme butanol ved slutten av sin eksponensielle vekstfasen rett før det går inn i stasjonær fase. På dette punkt, blir det følsomme for butanol og andre fermenteringsprodukter, og danner hvilendosporer som opphøre å syntetisere produktet. Siden transposomes har blitt brukt til å studere Clostridium perfringens ^3, kan det være mulig å bruke en lignende transposome / loxP / ere rekombinase system for å konstruere en stamme av C. acetobutylicum som mangler genene for uønskede gjæringsprodukter og sporulering, men inneholder gener for større butanol toleranse. Denne belastningen vil øke produktutbytte med minimal forurensning.

Oppsummert gir denne videoen tidsskrift en komplett step for steg beskrivelse av de prosedyrer som brukes til å lage auxotrophs av transposon mutagenese. Den dekker innføre transposome ved elektroporering screening for mutasjoner av kopiplate, redde muterte gener ved kloning teknikker og identifisering av avbrutte gener ved DNA-sekvensering. Denne teknikken kan brukes til å identifisere den ukjente funksjon av gener, eller for eventuelt å konstruere en bakteriestamme som kan anvendes i en industriell prosess.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
EZ-Tn5 R6Kγori/KAN-2 Tnp Transposome Kit	Epicentre (Illumina)	TSM08KR
EC100D pir+ Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	ECP09500	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a low copy number
EC100D pir-116 Electrocompetent E. coli	Epicentre (Illumina)	EC6P095H	Capable of replicating plasmids with an R6Kγ replication origin at a high copy number
5X M-9 Salts	Thermo Fisher	DF048517
Lennox LB Broth	Thermo Fisher	BP1427-2
Agar	Amresco, Inc.	J637-1KG	Solid media contained 1.6% (w/v) agar
Kanamycin Sulfate	Amresco, Inc.	0408-25G	When required, media contained 50 μg/ml kanamycin sulfate
D-Glucose Monohydrate	Amresco, Inc.	0643-1KG
Yeast Extract	Amresco, Inc.	J850-500G
Tryptone	Amresco, Inc.	J859-500G
KCl	Sigma-Aldrich	P4504-500G
NaCl	Amresco, Inc.	X190-1KG
MgCl2	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO2	Fisher Scientific	BP213-1
Super Optimal Broth with Catabolite Repression (SOC) medium			0.5% (w/v) yeast extract, 2% (w/v) tryptone, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 20 mM MgSO4 and 20 mM Glucose
BfuC I	NEB	R0636S	Partial digestion of genomic DNA
Xho I	NEB	R0146S	Plasmid digestion
T4 DNA Ligase	NEB	M0202S
Nuclease Free Water	Amresco, Inc.	E476-1L	For dissolving precipitated DNA and restriction endonuclease reactions
GenomeLab DTCS - Quick Start Kit	Beckman Coulter	608120	DNA sequencing
Wizard Genomic DNA Purification Kit	Promega	A1120A
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System	Promega	A1460	Plasmid purification
Replica Plating Block	Thermo Fisher	09-718-1
Velveteen Squares	Thermo Fisher	09-718-2	Replica plating
PetriStickers	Diversified Biotech	PSTK-1100	Grid for replica plating
Petri Dishes	Thermo Fisher	FB0875712
Gene Pulser II	BioRad		Electroporation
Electroporation Cuvettes – 2 mm	BioExpress	E-5010-2
CentriVap DNA Vacuum Concentrator	Labconco	7970010	Drying DNA
CEQ 2000XL DNA Analysis System	Beckman Coulter		DNA sequencing
Vector NTI Advance 11.5.0	Life Technologies	12605099	DNA sequence analysis