جيل من سمك ثلاثي الأبعاد الجلد كامل أي ما يعادل واصابة الآلي
Summary
The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.
Abstract
In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.
Introduction
الجلد هو أكبر عضو في الجسم. فإنه يخلق حاجزا بين البيئة الخارجية والأعضاء الداخلية. وعلاوة على ذلك، والجلد يحمي الجسم من فقدان السوائل، والتأثيرات البيئية والإصابات والالتهابات ويساعد على تنظيم درجة حرارة الجسم 1. نظرا لموقعها المكشوفة، وغالبا ما يتأثر الجلد عن طريق الصدمات الميكانيكية والحرارية أو الكيميائية. على الرغم من أن الجلد قادر عموما من إصلاح الذات، ويمكن لعوامل محلية متعددة مثل العدوى، والأوكسجين، والاكتفاء الوريدي يؤدي إلى ضعف التئام الجروح. ويمكن أيضا التئام الجروح أن تدخلت عوامل جهازية مثل السمنة، وإدمان الكحول، والتدخين، والأدوية، والتغذية، والأمراض مثل مرض السكري. 2
ويمكن تقسيم عملية التئام الجروح إلى 3 مراحل: (ط) المرحلة التهابات، (ب) والتكاثري و(ج) مرحلة التجديد. على إصابة الجلد، وتبدأ عملية معقدة إشارة الشلال، مما أدى إلى إغلاق الجرح. 3بعد الإصابة، الجرح ينزف ويتم تشكيل لتجلط الدم. الليفية تتحرك في تجلط الدم واستبدالها الأنسجة الجديدة التي تم تشكيلها في وقت لاحق على مدى سنوات.
الفهم الحالي للإصلاح الجلدي العمليات البيولوجية الكامنة محدودة. وقد استخدمت النماذج الحيوانية والخنازير الصغيرة لدراسة التئام الجروح. ومع ذلك، فإن هذه النتائج لا يمكن نقلها مباشرة إلى البشر يرجع إلى الاختلافات بين الأنواع محددة. وبالإضافة إلى هذه النماذج في الجسم الحي، وبعض جوانب التئام الجروح يمكن دراستها من خلال محاكاة الوضع الجرح عن طريق الخدش في المختبر الثقافات أحادي الطبقة على أساس خطوط الخلايا خلد أو الخلايا الأولية. 4 وهذه النماذج الخدش موحدة للغاية ولكن لا يعكس بما فيه الكفاية تعقيدا في الجسم الحي علم وظائف الأعضاء. 5 وإلى جانب النماذج ثنائية الأبعاد، وقد وضعت ثلاثية الأبعاد في حكمه الجلد البشري للأبحاث الأمراض الجلدية. الجزء الجلدي من هذه النماذج وجنرال الكتريكnerated باستخدام مختلف السقالات بما في ذلك الأدمة decellularized، 6 الهلاميات المائية الكولاجين، 7،8 الجليكوزامينوجليكان 9 أو المواد الاصطناعية. 10 توظيف هذه حكمه الجلد، ودور طلائي الوسيطة التفاعلات 11، وإعادة الاندمال بتشكل النسيج الظهاري، والحديث المتبادل الخلوي بين الخلايا الليفية والخلايا الكيراتينية و تأثير عوامل النمو المختلفة يمكن دراستها. وعلاوة على ذلك، وهذه النماذج هي مفيدة لاكتساب معارف جديدة حول كيفية تهاجر الخلايا الليفية إلى منطقة الجرحى وكيف تؤثر عوامل الانجذاب الكيميائي تجديد الأنسجة. 12
ليس فقط جيل من التئام الجروح النموذج نفسه هو أمر صعب، ولكن أيضا لإنشاء الجرح موحد للغاية في النموذج هو إشكالية. التقنيات الشائعة لخلق الجروح هي اختبارات الصفر، 13 والحروق، 14 الشريط التآكل، و15 إصابة الحرارية، 16 بثور شفط والنيتروجين السائل 17، 18 أشعة الليزر، و19 </سوب> المشارط، 18 meshers 6 و اللكمات الخزعة. 20 ومعظم هذه الطرق لها نفس المزالق. إصابات تنفيذها يدويا من الصعب توحيد وإعادة إنتاج بين اختبارات متعددة. حجم وشكل وعمق الجرح تختلف بين الدراسات، وبالتالي يؤثر سلبا على نوعية البيانات البحثية. استخدام الليزر لتعريف جرح الجلد يمكن موحدة بسهولة نسبيا ولكن يؤدي إلى حالة محاكاة حروق. الحرارة التي تطبقها ليزر يمكن أن يسبب البروتين تمسخ، الصفائح الدموية أو تجميع السفن انقباض، والتي يمكن أن تؤدي إلى الأنسجة الميتة.
في نهج بديل، قمنا بتطوير جهاز جرح الآلي (AWD)، والذي يسمح لنا لتوليد الجروح الجلدية محددة ودقيقة تحت ظروف معقمة. المعلمات إصابة، مثل عمق وسرعة الاختراق وكذلك الثورات من رأس الحفر يمكن تنظيمها. في هذه الدراسة، ونحن الجمع بين AWD مع في منزل وضعت سمك الكامل في حكمه الجلد (قدمSE) التي هي مماثلة لبروتوكول نشرتها Gangatirkar وآخرون. 8 طبقة الجلد ما يعادل الجلد يتكون من الخلايا الليفية الجلدية الإنسان (اتش دي اف)، والتي هي جزء لا يتجزأ في الكولاجين I هيدروجيل. على طبقة الجلد، الكيراتينية البشرة الإنسان (كلوة) هي المصنفة. في غضون أسبوعين في واجهة الهواء السائل وكلوة بناء على البشرة يتألف من عدة طبقات الخلايا الحيوية والطبقة القرنية. إلى جانب جيل من هذا النموذج، وتظهر هذه الدراسة استخدام AWD لخلق جروح محددة ودقيقة في مؤشر فاينانشال تايمز.
Protocol
Representative Results
Discussion
في الخلايا في المختبر عادة ما يتم توسيع في مزارع الخلايا ثنائية الأبعاد، في الخلايا التي تلتزم الأسطح البلاستيكية. ومع ذلك، هذه الشروط الثقافة لا تعكس الظروف ثلاثية الأبعاد الفسيولوجية التي تنمو الخلايا في الجسم الحي. في ظل ظروف ثلاثية الأبعاد، يمكن ل…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Fraunhofer ISC for the collaboration concerning the construction of the automated wounding device. The project was founded by Fraunhofer internal project “Märkte von Übermorgen” (SkinHeal).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232,5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2,5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7,5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7,5 ml) |
| Skin model submers medium (500ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0,62% (3,1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML |
References
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. The wound healing process. Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).
- Cory, G. Scratch-wound assay. Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).
- Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).
- Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).
- Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).
- Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).
- El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).
- Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).
- Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).
- Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).
- Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).
- Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).
- Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).
- Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).
- El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).
- Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).
- Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).
- Bell, E., et al. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of ‘simplified’ skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, 219-222 (1984).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
