The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.
In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.
A pele é o maior órgão do corpo. Ela cria uma barreira entre o ambiente externo e os órgãos internos. Além disso, a pele protege o corpo contra a perda de fluido, as influências ambientais, infecções e lesões e ajuda a regular a temperatura do corpo 1. Devido à sua localização exposta, a pele é frequentemente afetada pelo trauma mecânico, térmico ou químico. Embora a pele é geralmente capaz de auto-reparo, múltiplos fatores locais, como infecção, oxigenação e suficiência venosa pode levar a cicatrização de feridas prejudicada. Cicatrização de feridas também pode ser interferido por fatores sistêmicos como a obesidade, alcoolismo, tabagismo, medicação, nutrição e doenças como a diabetes. 2
O processo de cicatrização de feridas pode ser dividida em três fases: (i) a fase inflamatória, (ii) o proliferativas e o (iii) em fase de remodelação. Após lesão da pele, um sinal complexo inicia-cascata, levando ao encerramento da ferida. 3Após um traumatismo, a ferida é sangramento e um coágulo sanguíneo é formado. Os fibroblastos passar para o coágulo de sangue e substituí-lo por um novo tecido que seja posteriormente remodelada ao longo dos anos.
O entendimento atual da reparação cutânea processos biológicos subjacente é limitado. Pequenos modelos animais e de suínos têm sido usados para estudar a cicatrização de feridas. No entanto, estes resultados não podem ser transferidos diretamente para os seres humanos devido a diferenças específicas de cada espécie. Em adição a estes modelos in vivo, alguns aspectos da cicatrização de feridas pode ser estudado através da simulação de uma situação de ferida através de riscar em culturas de monocamada in vitro com base em linhas celulares imortalizadas ou células primárias. 4 Estes modelos riscar são altamente padronizados, mas não suficientemente reflectir o fisiologia complexo in vivo. Além disso 5 modelos bidimensionais, tridimensionais equivalentes de pele humana foram desenvolvidas para a investigação dermatológica. A parte dérmica desses modelos são generated utilizando diversos suportes, incluindo derme decelularizados, 6 hidrogéis colágeno, 7,8 glicosaminoglicanos 9 ou materiais sintéticos. 10 Empregando estas equivalentes de pele, o papel das interações epitélio-mesenquimal 11, a re-epitelização, o crosstalk celular entre fibroblastos e queratinócitos e a influência de diferentes factores de crescimento pode ser estudada. Além disso, estes modelos são úteis para obter novos conhecimentos sobre como fibroblastos migram para a área ferida e como fatores quimiotáticos influenciar a regeneração dos tecidos 12.
Não só geração do próprio modelo a cicatrização de feridas é um desafio, mas também para estabelecer uma ferida altamente padronizada em um modelo é problemático. As técnicas comuns para criar as feridas são testes de risco, 13 queimaduras, 14 de fita de abrasão, 15 lesões térmicas, 16 blisters de sucção, nitrogênio líquido 17, 18, 19 lasers </sup> bisturis, 18 meshers 6 e punções. 20 A maioria desses métodos têm as mesmas armadilhas. Lesões implementadas manualmente são difíceis de padronizar e se reproduzir entre vários testes. O tamanho, forma e profundidade da ferida variar entre estudos e, assim, prejudicar a qualidade dos dados de pesquisa. O uso do laser para ferir a pele pode ser definido de forma relativamente fácil padronizado, mas conduz a uma situação que imita queimaduras. O calor aplicado por laser pode provocar a desnaturação da proteína, agregação de plaquetas constrição ou navios, o que pode levar ao tecido necrótico.
Em uma abordagem alternativa, foi desenvolvido um dispositivo ferimento automatizado (AWD), que nos permite gerar feridas cutâneas definidas e precisas em condições estéreis. Parâmetros ferindo, como profundidade e velocidade de penetração, bem como as revoluções da cabeça de perfuração pode ser regulada. Neste estudo, nós combinamos o AWD com em casa desenvolvidos espessura completa equivalentes de pele (ftSE), que são comparáveis a um protocolo publicado por Gangatirkar et al. 8 a camada dérmica da pele equivalente é composta por fibroblastos dérmicos humanos (HDF), que são incorporados em colagénio I um hidrogel. Na camada dérmica, os queratinócitos epidérmicos humanos (HEK) são semeadas. Dentro de duas semanas na interface ar-líquido da HEK construir-se uma epiderme composta de várias camadas de células vitais e um estrato córneo. Para além da geração de este modelo, este estudo mostra a utilização do AWD para criar feridas definidos e precisos em FTSE.
Em células in vitro são normalmente expandido em culturas de células de duas dimensões, em que as células aderem a superfícies de plástico. No entanto, estas condições de cultura não reflectem as condições tridimensionais fisiológicas em que as células crescem in vivo. Sob condições tridimensionais, as células podem formar ligações célula-célula e célula-matriz naturais e migrar em três dimensões. Especialmente na cura de feridas cutâneas a semelhança da situação <e…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank the Fraunhofer ISC for the collaboration concerning the construction of the automated wounding device. The project was founded by Fraunhofer internal project “Märkte von Übermorgen” (SkinHeal).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid) | Produced in house | ||
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
Inserts | Nunc | 140627 | |
6 well plate | Nunc | 140685 | |
24 well plate | Nunc | 142485 | |
Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
Gel neutralization solution (250 ml): | |||
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232,5 ml) |
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2,5 ml) |
Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7,5 ml) |
HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7,5 ml) |
Skin model submers medium (500ml): | |||
Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2 |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0,62% (3,1 ml) |
Histology: | |||
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
CK10 antibody | Dako | M7002 | |
Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
H&E staining | |||
Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML |