Генерация трехмерной всю толщину кожи Эквивалент техники и автоматизированных Ранение
Summary
The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.
Abstract
In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.
Introduction
Кожа является самым большим органом тела. Это создает барьер между внешней средой и внутренними органами. Кроме того, кожа защищает организм от потери жидкости, воздействия окружающей среды, травм и инфекций и помогает регулировать температуру тела 1. Из-за его открытом месте, кожа часто зависит от механического, термического или химического травмы. Хотя кожа, как правило, способны самовосстановления, несколько местные факторы, такие как инфекции, оксигенации и венозного достаточности может привести к нарушению заживления ран. Заживление ран может быть также препятствуют системных факторов, как ожирение, алкоголизм, курение, лекарства, питание и заболеваний, таких как диабет. 2
Процесс заживления ран можно разделить на три фазы: (I) воспалительной фазы, (II) пролиферативных и (III) фазы ремоделирования. По травма кожи, комплексный сигнал-каскад начинается, что приводит к закрытию раны. 3После травмы, раны кровотечение и сгусток крови формируется. Фибробласты двигаться в сгусток крови и заменить его новой ткани, которая впоследствии перестроенный в течение многих лет.
Современное понимание биологических процессов, лежащих кожного ремонта ограничено. Маленькие животные и свиньи модели были использованы для изучения заживления ран. Тем не менее, эти результаты не могут быть непосредственно переданы для человека из-за различий видоспецифичных. В дополнение к этим моделям в естественных условиях, некоторые аспекты заживления ран могут быть изучены путем имитации раны ситуацию с помощью царапин в пробирке монослойных культур на основе иммортализованных клеточных линий или первичных клеток. 4 Эти царапин модели, являются высоко стандартизованными, но не в достаточной степени отражает Комплекс в естественных физиологии. 5 Кроме двумерных моделей, трехмерные человека эквивалентов кожи были разработаны для дерматологических исследований. Кожная часть из этих моделей GEnerated, используя различные каркасы в том числе decellularized дермы, 6 коллагена гидрогели, 7,8 гликозаминогликанов 9 или синтетических материалов. 10 Используя эти эквиваленты кожи, роль эпителиальных-мезенхимальных взаимодействий 11, реэпителизацию, сотовый перекрестные помехи между фибробластов и кератиноцитов и Влияние различных факторов роста могут быть изучены. Кроме того, эти модели являются полезными, чтобы получить новые знания о том, как фибробласты мигрируют в раненого области и как хемотаксический факторы влияют на регенерацию тканей. 12
Не только поколение самой модели заживления раны является сложной задачей, но и установить максимально стандартизированные рана в модели является проблематичным. Общие методы, чтобы создать раны от царапин тесты, 13 ожоги, 14 ленты истиранию, 15 термическое повреждение, 16 всасывающие волдыри, 17 жидкий азот, 18 лазеров, 19 </SUP> скальпели, 18 meshers 6 и биопсия удары. 20 Большинство из этих методов имеет те же подводные камни. Травмы, осуществляемые вручную трудно стандартизировать и воспроизводить между многократными испытаниями. Размер, форма и глубина раны варьироваться в зависимости от исследований и тем самым отрицательно повлиять на качество исследовательских данных. Использование лазера для определенного ранения кожи может быть относительно легко стандартизировать, но приводит к тому, имитирующих ран ожога. Тепловая обработка с помощью лазера может привести к денатурации белка, агрегацию тромбоцитов или суда сужение, которое может привести к некротической ткани.
В качестве альтернативного подхода, мы разработали автоматизированную ранения устройство (AWD), которая позволяет нам создавать определенные и точные кожные раны в стерильных условиях. Ранении параметры, такие как глубина и скорость проникновения, а также оборотов буровой головки может регулироваться. В этом исследовании, мы совместили AWD с собственной разработки на полную толщину кожных эквивалентов (футыSE), что можно сравнить с протоколом, опубликованной Gangatirkar и др. 8 дермальный слой кожи эквивалента состоит из человеческих фибробластов кожи (HDF), которые встроены в коллагена I гидрогеля. На кожном слое, кератиноциты эпидермиса человека (НЕК) высевают. В течение двух недель на границе воздух-жидкость НЕК создать эпидермиса, состоящий из нескольких жизненно важных клеточных слоев и рогового слоя. Кроме того, поколения этой модели, это исследование показывает, использование AWD для создания определенным и точным раны в FTSE.
Protocol
Representative Results
Discussion
В пробирке клеток, как правило, расширены в двумерных клеточных культур, в которых клетки прилипают к пластиковой поверхности. Тем не менее, эти условия культивирования не отражают физиологическое трехмерные условий, в которых клетки растут в естественных условиях. Под трехм…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Fraunhofer ISC for the collaboration concerning the construction of the automated wounding device. The project was founded by Fraunhofer internal project “Märkte von Übermorgen” (SkinHeal).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232,5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2,5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7,5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7,5 ml) |
| Skin model submers medium (500ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0,62% (3,1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML |
References
- Proksch, E., Brandner, J. M., Jensen, J. M. The skin: an indispensable barrier. Exp Dermatol. 17, 1063-1072 (2008).
- Guo, S., Dipietro, L. A. Factors affecting wound healing. J Dent Res. 89, 219-229 (2010).
- Kirsner, R. S., Eaglstein, W. H. The wound healing process. Dermatol Clin. 11, 629-640 (1993).
- Cory, G. Scratch-wound assay. Methods Mol Biol. 769, 25-30 (2011).
- Sun, T., Jackson, S., Haycock, J. W., MacNeil, S. Culture of skin cells in 3D rather than 2D improves their ability to survive exposure to cytotoxic agents. J Biotechnol. 122 (3), 372-381 (2006).
- Harrison, C. A., Heaton, M. J., Layton, C. M., Mac Neil, S. Use of an in vitro model of tissue-engineered human skin to study keratinocyte attachment and migration in the process of reepithelialization. Wound Repair Regen. 14 (2), 203-209 (2006).
- Wilkins, L. M., Watson, S. R., Prosky, S. J., Meunier, S. F., Parenteau, N. L. Development of a bilayered living skin construct for clinical applications. Biotechnol Bioeng. 43 (8), 747-756 (1994).
- Gangatirkar, P., Paquet-Fifield, S., Li, A., Rossi, R., Kaur, P. Establishment of 3D organotypic cultures using human neonatal epidermal cells. Nat Protoc. 2 (1), 178-186 (2007).
- Boyce, S. T. Skin substitutes from cultured cells and collagen-GAG polymers. Med Biol Eng Comput. 36 (6), 791-800 (1998).
- El-Ghalbzouri, A., Lamme, E. N., van Blitterswijk, C., Koopman, J., Ponec, M. The use of PEGT/PBT as a dermal scaffold for skin tissue engineering. Biomaterials. 25 (5), 2987-2996 (2004).
- Maas-Szabowski, N., Shimotoyodome, A., Fusenig, N. E. Keratinocyte growth regulation in fibroblast cocultures via a double paracrine mechanism. J Cell Sci. 112 (Pt 12), 1843-1853 (1999).
- Coolen, N. A., Vlig, M., vanden Bogaerdt, A. J., Middelkoop, E., Ulrich, M. M. Development of an in vitro burn wound model. Wound Repair Regen. 16 (4), 559-567 (2008).
- Oberringer, M., Meins, C., Bubel, M., Pohlemann, T. A new in vitro wound model based on the co-culture of human dermal microvascular endothelial cells and human dermal fibroblasts. Biol Cell. 99 (4), 197-207 (2007).
- Cribbs, R. K., Luquette, M. H., Besner, G. E. A standardized model of partial thickness scald burns in mice. J Surg Res. 80 (1), 69-74 (1998).
- Reed, J. T., Ghadially, R., Elias, P. M. Skin type, but neither race nor gender, influence epidermal permeability barrier function. Arch Dermatol. 131 (10), 1134-1138 (1995).
- Pilcher, B. K., et al. Keratinocyte collagenase-1 expression requires an epidermal growth factor receptor autocrine mechanism. J Biol Chem. 274 (15), 10372-10381 (1999).
- Blank, I. H., Miller, O. G. A method for the separation of the epidermis from the dermis. J Invest Dermatol. 15 (1), 9-10 (1950).
- El Ghalbzouri, A., et al. Fibroblasts facilitate re-epithelialization in wounded human skin equivalents. Lab Invest. 84 (1), 102-112 (2004).
- Vaughan, M. B., et al. A reproducible laser-wounded skin equivalent model to study the effects of aging in vitro. Rejuvenation Res. 7 (2), 99-110 (2004).
- Geer, D. J., Swartz, D. D., Andreadis, S. T. In vivo model of wound healing based on transplanted tissue-engineered skin. Tissue Eng. 10 (7-8), 1006-1017 (2004).
- Bell, E., et al. The reconstitution of living skin. J Invest Dermatol. 81 (1 Suppl), 2s-10s (1983).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of ‘simplified’ skin: control of fabrication. Br J Dermatol. 111, 219-222 (1984).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
