Génération d'une épaisseur en trois dimensions équivalent de peau et automatisé Blessant

Summary

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Abstract

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

Introduction

La peau est le plus grand organe du corps. Il crée une barrière entre l'environnement extérieur et les organes internes. En outre, la peau protège le corps contre la perte de liquide, influences de l'environnement, des blessures et des infections et aide à réguler la température corporelle ^1. Grâce à sa situation exposée, la peau est souvent affectée par un traumatisme mécanique, thermique ou chimique. Bien que la peau est généralement capable d'auto-réparation, de multiples facteurs locaux tels que l'infection, l'oxygénation, et la suffisance veineuse peuvent conduire à la guérison des plaies. La cicatrisation des plaies peut également être perturbé par des facteurs systémiques que l'obésité, l'alcoolisme, le tabagisme, les médicaments, la nutrition et les maladies telles que le diabète. ²

Le processus de la cicatrisation peut être divisé en trois phases: (i) la phase inflammatoire, (ii) la prolifération et de la (iii) la phase de remodelage. Après une blessure de la peau, une cascade complexe de signal commence, conduisant à la fermeture de la plaie. ³Après une blessure, la plaie saigne et un caillot de sang se forme. Fibroblastes se déplacent dans le caillot de sang et le remplacer par un nouveau tissu qui est ensuite remodelé au fil des ans.

La compréhension actuelle de la réparation cutanée processus biologiques sous-jacent est limitée. Petits modèles animaux et de porcs ont été utilisées pour étudier la cicatrisation des plaies. Cependant, ces résultats ne peuvent être directement transmises à l'homme en raison des différences spécifiques à l'espèce. En plus de ces modèles in vivo, certains aspects de la cicatrisation des plaies peuvent être étudiés en simulant une situation de la plaie par l'intermédiaire de rayer in vitro des cultures monocouches à base sur des lignées cellulaires immortalisées ou des cellules primaires. ⁴ Ces modèles de grattage sont très normalisées, mais ne reflètent pas suffisamment la la physiologie complexe in vivo. ⁵ Outre les modèles en deux dimensions, les équivalents en trois dimensions peau humaine ont été développés pour la recherche dermatologique. La partie cutanée de ces modèles sont geexonéré en utilisant divers échafaudages comprenant derme décellularisées, ⁶ hydrogels de collagène, ^7,8 glycosaminoglycanes ⁹ ou de matériaux synthétiques. ¹⁰ L'utilisation de ces équivalents de peau, le rôle des interactions épithélium-mésenchyme ^11, la ré-épithélialisation, la diaphonie cellulaire entre les fibroblastes et les kératinocytes et la influence de différents facteurs de croissance peut être étudiée. En outre, ces modèles sont utiles pour acquérir de nouvelles connaissances sur la façon dont les fibroblastes migrent dans la zone blessés et comment les facteurs chimiotactique influencent la régénération des tissus. ¹²

Non seulement la génération du modèle de cicatrisation de la plaie elle-même est difficile, mais également pour établir une plaie hautement standardisée en un modèle est problématique. Techniques communes visant à créer des blessures sont des tests à gratter, ^{13, 14} brûlures bande abrasion, ¹⁵ blessure thermique, ¹⁶ ampoules d'aspiration, de l'azote liquide ^{17, 18, ​​19} lasers </sup> scalpels, ¹⁸ mailleurs ⁶ et poinçons de biopsie. ²⁰ La plupart de ces méthodes ont les mêmes pièges. Blessures mises en œuvre manuellement sont difficiles à normaliser et à reproduire entre plusieurs tests. Taille, forme et la profondeur de la plaie varient entre les études et donc nuisent à la qualité des données de recherche. L'utilisation de laser pour blessure défini de la peau peut être relativement facile à normaliser mais conduit à une situation imitant des brûlures. La chaleur appliquée par laser peut provoquer la dénaturation des protéines, l'agrégation des plaquettes ou des navires constriction, ce qui peut conduire à des tissus nécrosés.

Dans une autre approche, nous avons développé un dispositif automatisé de blessure (AWD), ce qui nous permet de générer plaies cutanées définis et précis dans des conditions stériles. Blessant paramètres, comme la profondeur et la vitesse de pénétration ainsi que les révolutions de la tête de forage peuvent être réglementés. Dans cette étude, nous avons combiné l'AWD avec la pleine épaisseur équivalents développés en interne de la peau (ftSE) qui sont comparables à un protocole publié par Gangatirkar et al. ⁸ La couche dermique de l'équivalent de peau est constitué de fibroblastes dermiques humains (HDF), qui sont noyés dans un collagène I hydrogel. Sur la couche dermique, kératinocytes épidermiques humains (HEK) sont ensemencées. Dans les deux semaines à l'interface air-liquide du hek accumuler un épiderme composé de plusieurs couches de cellules vitales et un stratum corneum. Outre la génération de ce modèle, cette étude montre l'utilisation de la traction intégrale pour créer blessures bien précises à FTSE.

Protocol

NOTE: Le protocole est conçu pour la production de 24 équivalents de pleine épaisseur de la peau. Fibroblastes dermiques et les kératinocytes épidermiques humains ont été isolés à partir de biopsies de la peau selon un protocole précédemment publié. 21,22 consentement éclairé a été obtenu au préalable et l'étude a été approuvé par le comité d'éthique institutionnels sur la recherche humaine de Julius-Maximilians-Université de Würzburg (voter 182 / 10). <p class="jove_title…

Representative Results

La isolée HDF et Hek diffèrent à la fois dans la morphologie et de l'expression de marqueurs typiques. HDF a montré la morphologie typique broche en forme, alors que la morphologie de Hek peut être décrit par une morphologie pavée. Les cellules ont été caractérisées par une coloration immunohistochimique (Figure 1) avant de les utiliser pour FTSE. Le HDF sont positives pour la vimentine (Figure 1A), un marqueur de fibroblastes. HEK primaire exprimer très précoce de diff…

Discussion

Dans les cellules in vitro sont généralement étendu dans des cultures cellulaires bidimensionnelles, dans lequel les cellules adhèrent aux surfaces plastiques. Cependant, ces conditions de culture ne reflètent pas les conditions physiologiques en trois dimensions dans laquelle les cellules se développent in vivo. Dans des conditions tridimensionnelles, les cellules peuvent former des attachements cellule-cellule et cellule-matrice naturelles et de migrer dans les trois dimensions. Surtou…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS	PAA	L11-003	0.05%
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid)	Produced in house
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserts	Nunc	140627
6 well plate	Nunc	140685
24 well plate	Nunc	142485
Microscope slides	R. Langenbrinck	03-0070
Fibroblasts culturing (500 ml):
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Keratinozyten culture medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Gel neutralization solution (250 ml):
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine	PAA	G0001,3010	93% (232,5 ml)
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	3% (7,5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7,5 ml)
Skin model submers medium (500ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Fetal calf serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell	C-39011	adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0,62% (3,1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
CK14 antibody	Sigma	HPA023040-100µl
CK10 antibody	Dako	M7002
Filaggrin antibody	Abcam	ab81468
H&E staining
Mayer´s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Mounting Medium	Sigma Aldrich	M1289-10ML