Generazione di una tridimensionale a tutto spessore della pelle Equivalent e Automated Ferimento
Summary
The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.
Abstract
In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.
Introduction
La pelle è l'organo più grande del corpo. Si crea una barriera tra l'ambiente esterno e gli organi interni. Inoltre, la pelle protegge il corpo da perdita di liquidi, le influenze ambientali, ferite e infezioni e aiuta a regolare la temperatura corporea 1. Grazie alla sua posizione esposta, la pelle è spesso influenzata da traumi meccanici, termici o chimici. Anche se la pelle è generalmente in grado di auto-riparazione, molteplici fattori locali, come l'infezione, l'ossigenazione, e la sufficienza venosa può portare a compromissione della guarigione della ferita. La guarigione delle ferite può essere disturbato da fattori sistemici come l'obesità, l'alcolismo, il fumo, i farmaci, la nutrizione e le malattie come il diabete. 2
Il processo di guarigione della ferita può essere divisa in 3 fasi: (i) la fase infiammatoria, (ii) la proliferativi e (iii) fase di rimodellamento. Su lesioni alla pelle, un complesso segnale cascade inizia, che porta alla chiusura della ferita. 3Dopo l'infortunio, la ferita sanguina e un coagulo di sangue si forma. I fibroblasti muovono nel coagulo di sangue e sostituirlo con nuovo tessuto che viene successivamente ristrutturato nel corso degli anni.
L'attuale comprensione della riparazione cutanea processi biologici di base è limitata. Modelli piccoli animali e suini sono stati utilizzati per studiare la guarigione delle ferite. Tuttavia, questi risultati non possono essere trasferiti direttamente all'uomo a causa di differenze specifiche specie. Oltre a questi modelli in vivo, alcuni aspetti della guarigione delle ferite possono essere studiati simulando una situazione ferita con graffiare in vitro colture monostrato basato su linee cellulari immortalizzate o cellule primarie. 4 Questi modelli razzolare altamente standardizzati ma non sufficientemente riflettono la complesso la fisiologia in vivo. 5 Oltre ai modelli bidimensionali, tridimensionali equivalenti pelle umana sono stati sviluppati per la ricerca dermatologica. La parte cutanea di questi modelli sono generated utilizzando vari ponteggi compresi derma decellularized, 6 idrogel di collagene, glicosaminoglicani 7,8 9 o materiali sintetici. 10 Impiegando questi equivalenti pelle, il ruolo delle interazioni epiteliali-mesenchimali 11, la riepitelizzazione, la diafonia tra cellulare fibroblasti e cheratinociti e influenza dei diversi fattori di crescita può essere studiato. Inoltre, questi modelli sono utili per acquisire nuove conoscenze su come fibroblasti migrano nella zona ferita e come fattori chemiotattici influenzano la rigenerazione dei tessuti. 12
Non solo la generazione del modello guarigione della ferita in sé è impegnativo, ma anche per stabilire una ferita altamente standardizzato in un modello è problematico. Tecniche comuni per creare le ferite sono test e vinci, 13 ustioni, 14 nastro abrasione, 15 lesioni termiche, 16 blister di aspirazione, l'azoto liquido 17, 18 laser, 19 </sup> bisturi, 18 meshers 6 e pugni biopsia. 20 La maggior parte di questi metodi hanno le stesse insidie. Gli infortuni implementate manualmente sono difficili da standardizzare e riprodurre tra più prove. Dimensioni, forma e profondità della ferita variano tra gli studi e quindi compromettono la qualità dei dati di ricerca. L'uso del laser per ferire la pelle definito può essere relativamente facile standardizzato, ma porta ad una situazione mimando ustioni. Il calore applicato dal laser può causare denaturazione delle proteine, le piastrine aggregazione o vasi costrizione, che può portare a tessuto necrotico.
In un approccio alternativo, abbiamo sviluppato un dispositivo ferimento automatico (AWD), che ci permette di generare le ferite cutanee definiti e precisi in condizioni sterili. Parametri ferimento, come la profondità e la velocità di penetrazione e giri la testa di perforazione sono regolabili. In questo studio, abbiamo combinato l'AWD con in casa sviluppati spessore pieno equivalenti pelle (ftSE) che sono paragonabili a un protocollo pubblicato da Gangatirkar et al. 8 Lo strato dermico dell'equivalente pelle è composto di fibroblasti dermici umani (HDF), che sono incorporati in un collagene I idrogel. Sullo strato dermico, cheratinociti epidermici umani (HEK) sono teste di serie. Entro due settimane all'interfaccia aria-liquido la HEK costruire una epidermide composta di vari strati di cellule vitali e un strato corneo. Oltre alla generazione di questo modello, questo studio mostra l'uso del awd per creare ferite definite e precise in FTSE.
Protocol
Representative Results
Discussion
In cellule in vitro sono normalmente espanso in colture cellulari bidimensionali, in cui le cellule aderiscono a superfici plastiche. Tuttavia, queste condizioni di coltura non riflettono le condizioni tridimensionali fisiologiche in cui le cellule crescono in vivo. In condizioni tridimensionali, le cellule possono formare allegati cellula-cellula e cellula-matrice naturali e migrare in tre dimensioni. Soprattutto nella ferita cutanea guarigione la somiglianza della situazione in vivo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Fraunhofer ISC for the collaboration concerning the construction of the automated wounding device. The project was founded by Fraunhofer internal project “Märkte von Übermorgen” (SkinHeal).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232,5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2,5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7,5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7,5 ml) |
| Skin model submers medium (500ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0,62% (3,1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML |
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