एक तीन आयामी पूर्ण मोटाई त्वचा की पीढ़ी के बराबर है और स्वचालित लोग घायल हो गए
Summary
The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.
Abstract
In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.
Introduction
त्वचा शरीर का सबसे बड़ा अंग है। यह बाहरी वातावरण और आंतरिक अंगों के बीच एक बाधा पैदा करता है। इसके अलावा, त्वचा द्रव नुकसान, पर्यावरणीय प्रभावों, चोटों और संक्रमण से शरीर की रक्षा करता है और शरीर का तापमान एक विनियमित करने में मदद करता है। कारण इसकी उजागर स्थान के लिए, त्वचा अक्सर, यांत्रिक थर्मल या रासायनिक आघात से प्रभावित है। त्वचा स्वयं की मरम्मत का आम तौर पर सक्षम है हालांकि, इस तरह के संक्रमण, ऑक्सीजन, और शिरापरक प्रचुरता के रूप में कई स्थानीय कारकों बिगड़ा घाव भरने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। घाव भरने में भी मोटापा, शराब, धूम्रपान, दवा, पोषण और मधुमेह जैसे रोगों के रूप में प्रणालीगत कारकों से दखल किया जा सकता है। 2
(मैं) भड़काऊ चरण (ii) प्रफलन और (iii) remodeling के चरण: घाव भरने की प्रक्रिया तीन चरणों में विभाजित किया जा सकता है। त्वचा को चोट करने पर, एक जटिल संकेत-झरना घाव को बंद करने के लिए अग्रणी शुरू होता है। 3चोट के बाद, घाव से खून बह रहा है और एक खून का थक्का का गठन किया है। Fibroblasts खून का थक्का में कदम और बाद में पिछले कुछ वर्षों में remodeled है जो नए ऊतक के साथ बदलें।
जैविक प्रक्रियाओं अंतर्निहित त्वचीय मरम्मत की वर्तमान समझ सीमित है। छोटे जानवर और सुअर मॉडल घाव भरने का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, इन परिणामों सीधे प्रजाति विशिष्ट मतभेद के कारण मनुष्य के लिए स्थानांतरित नहीं किया जा सकता है। इन vivo में मॉडल के अलावा, घाव भरने के कुछ पहलुओं 4 ये scratching मॉडल अत्यधिक मानकीकृत कर रहे हैं। अमर सेल लाइनों या प्राथमिक कोशिकाओं के आधार पर इन विट्रो monolayer संस्कृतियों के scratching के माध्यम से एक घाव स्थिति का अनुकरण द्वारा अध्ययन किया जा सकता है, लेकिन पर्याप्त रूप से प्रतिबिंबित नहीं करते परिसर में विवो फिजियोलॉजी। 5 दो आयामी मॉडल के अलावा, तीन आयामी मानव त्वचा समकक्ष dermatological अनुसंधान के लिए विकसित किया गया है। इन मॉडलों के चमड़े का हिस्सा जीई हैंnerated decellularized डर्मिस, 6 कोलेजन हाइड्रोजेल, 7,8 glycosaminoglycans 9 या सिंथेटिक सामग्री सहित विभिन्न scaffolds के प्रयोग से। 10 इन त्वचा समकक्ष रोजगार, उपकला-mesenchymal बातचीत 11 की भूमिका, पुनः epithelialization, fibroblasts और केरेटिनकोशिकाओं और बीच सेलुलर crosstalk विभिन्न विकास कारकों के प्रभाव का अध्ययन किया जा सकता है। इसके अलावा, इन मॉडलों fibroblasts के घायल क्षेत्र में विस्थापित और कैसे chemotactic कारकों ऊतक पुनर्जनन को कैसे प्रभावित करती बारे में नए ज्ञान हासिल करने के लिए उपयोगी होते हैं। 12
घाव भरने मॉडल ही की न केवल पीढ़ी चुनौती दे रहा है, लेकिन यह भी एक मॉडल में एक अत्यधिक मानकीकृत घाव समस्याग्रस्त है स्थापित करने के लिए। आम तकनीकों घाव खरोंच परीक्षण, 13 जलता है, 14 टेप घर्षण, 15 थर्मल चोट, 16 सक्शन छाले, 17 तरल नाइट्रोजन, 18 लेजर, 19 कर रहे हैं बनाने के लिए </समर्थन> नलियां, 18 meshers 6 और बायोप्सी घूंसे। इन तरीकों में से 20 अधिकांश एक ही नुकसान है। मैन्युअल रूप से लागू की चोट लगने के मानकीकरण के लिए और कई परीक्षणों के बीच पुन: पेश करने के लिए मुश्किल हैं। आकार, आकृति और घाव की गहराई से अध्ययन के बीच भिन्न है और इस तरह के अनुसंधान डेटा की गुणवत्ता ख़राब। परिभाषित त्वचा लोग घायल हो गए के लिए लेजर का उपयोग अपेक्षाकृत आसानी से मानकीकृत लेकिन जला घाव नकल उतार एक ऐसी स्थिति की ओर जाता है किया जा सकता है। लेजर द्वारा लागू गर्मी परिगलित ऊतक को जन्म दे सकता है, जो प्रोटीन विकृतीकरण, प्लेटलेट्स एकत्रीकरण या वाहिकाओं कसना, पैदा कर सकता है।
एक वैकल्पिक दृष्टिकोण में, हम हमारे बाँझ शर्तों के तहत परिभाषित और सटीक त्वचीय घाव उत्पन्न करने के लिए अनुमति देता है जो एक स्वचालित लोग घायल हो गए डिवाइस (AWD), विकसित की है। गहराई और गति पैठ के रूप में अच्छी तरह से ड्रिल सिर की क्रांतियों की तरह लोग घायल हो गए मापदंडों, विनियमित किया जा सकता है। इस अध्ययन में, हम घर में विकसित पूर्ण मोटाई त्वचा समकक्ष के साथ AWD संयुक्त (एफटीGangatirkar एट अल द्वारा प्रकाशित एक प्रोटोकॉल के लिए तुलना कर रहे हैं कि एसई)। 8 त्वचा बराबर की त्वचीय परत मैं हाइड्रोजेल एक कोलेजन में एम्बेडेड रहे हैं जो मानव त्वचीय fibroblasts (HDF), से बना है। त्वचीय परत पर, मानव एपिडर्मल केरेटिनकोशिकाओं (HEK) वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। हवा तरल इंटरफेस में दो सप्ताह के भीतर HEK कई महत्वपूर्ण सेल परतों और एक परत corneum से बना एक एपिडर्मिस का निर्माण। इस मॉडल की पीढ़ी इसके अलावा, इस अध्ययन FTSE में परिभाषित और सटीक घाव बनाने के लिए AWD के उपयोग से पता चलता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इन विट्रो कोशिकाओं में आमतौर पर कोशिकाओं प्लास्टिक की सतहों का पालन करना है जिसमें दो आयामी सेल संस्कृतियों में विस्तार कर रहे हैं। हालांकि, इन संस्कृति शर्तों कोशिकाओं vivo में बढ़ने में जो श…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Fraunhofer ISC for the collaboration concerning the construction of the automated wounding device. The project was founded by Fraunhofer internal project “Märkte von Übermorgen” (SkinHeal).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232,5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2,5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7,5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7,5 ml) |
| Skin model submers medium (500ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0,62% (3,1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML |
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