3 차원 전체 두께 피부의 세대 동등한 및 자동화 부상
Summary
The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.
Abstract
In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.
Introduction
피부는 신체에서 가장 큰 기관이다. 그것은 외부 환경과 내부 장기 사이에 장벽을 만듭니다. 또한, 피부는 유체 손실, 환경 적 영향, 상처 감염으로부터 몸을 보호하고, 체온을 조절 한 것을 돕는다. 인해 노출 된 위치에, 피부는 종종, 기계적, 열적 또는 화학적 외상에 의해 영향을 받는다. 피부 자체 수리의 일반적으로 사용하는 것은 아니지만, 감염, 산소, 정맥 자족 여러 지역 요인 손상된 상처 치유 될 수 있습니다. 상처 치유는 비만, 알코올 중독, 흡연, 약물, 영양, 당뇨병과 같은 질환 등의 전신적인 요인에 의해 방해 할 수있다. (2)
(I) 염증 상, (II) 및 증식 (III) 리모델링 단계 : 상처 치유 과정은 3 단계로 나눌 수있다. 피부에 손상되면, 복잡한 신호 캐스케이드 상처의 폐쇄로 이어지는 시작합니다. 3손상 후 상처 출혈과 혈병이 형성된다. 섬유 아 세포는 혈액 응고로 이동하고 이후 년 동안 리모델링되어 새로운 조직으로 대체.
생물학적 과정의 기본 피부 복구 전류 이해는 제한된다. 작은 동물과 돼지 모델은 상처 치유를 연구하는 데 사용되었다. 그러나, 이러한 결과는 직접 종 특이 차이에 의해 인체에 전달 될 수 없다. 이러한 생체 내 모델에 추가하여, 상처 치료의 일부 양태들은 4 선택된 긁 모델 고도로 표준화. 불멸화 세포주 또는 일차 세포에 기초한 생체 외 단층 배양 스크래칭을 통해 상처 상황을 시뮬레이션에 의해 연구 할 수 있지만, 충분히 반영되지 않는다 복잡한 생체 내 생리. 5 이차원 모델은 또한, 삼차원 인간 피부 등가물 피부병 연구 개발되어왔다. 이 모델의 피부 부분은 GE 있습니다nerated 탈세 포화 진피 6 콜라겐 히드로 겔, 7,8 글리코 9 또는 합성 재료 등 다양한 지지체를 사용. (10)이 피부 등가물을 채용, 상피 간엽 상호 작용 (11)의 역할을, 재 상피화, 섬유 아세포 및 각질 세포 및 간 세포 누화 다른 성장 인자의 영향이 연구 될 수있다. 또한,이 모델은 섬유 아세포가 부상 영역으로 마이그레이션하는 방법과 화학 주성 인자가 조직 재생에 영향을 미치는 방법에 대한 새로운 지식을 습득하는데 유용하다. (12)
상처 치유 모델 자체의 생성뿐만 아니라 도전이지만, 또한 모델의 고도로 표준화 상처 문제가 확립. 일반적인 기술은 상처 스크래치 테스트, 13 화상, 14 테이프 마모, 15 열 손상, 16 흡입 물집, 17 액체 질소, 18 레이저, 19 있습니다 만들 수 있습니다 </SUP> 메스, 18 메쉬 작업자 6 생검 펀치. 이러한 방법 20 대부분 같은 함정이있다. 수동으로 구현 부상 표준화 및 여러 테스트를 사이에 재생하기 어렵습니다. 크기, 형상 및 상처의 깊이 연구 사이에서 변화하고, 따라서 연구 데이터의 품질이 저하. 정의 피부 상처 용 레이저의 사용은 비교적 용이하지만 표준화 화상 상처를 흉내 낸 상황에 이르게 할 수있다. 레이저에 의해 적용 열 괴사 조직으로 이어질 수 있습니다 단백질 변성, 혈소판 응집 또는 혈관 수축을 일으킬 수 있습니다.
대안적인 접근법에서, 우리는 우리가 멸균 조건 하에서 정확한 정의 및 피부 상처를 생성 할 수있는 자동화 된 상처 소자 (AWD)를 개발 하였다. 깊이 및 속도의 침투뿐만 아니라 드릴 헤드의 회전 수 등을 파라미터 상흔을 규제 할 수있다. 이 연구에서 우리는 집에서 개발 한 전체 두께 피부 등가물과 AWD를 결합 (피트Gangatirkar 등에 의해 발표 된 프로토콜에 비교할 SE). (8) 피부 상당의 피부 층은 내가 하이드로 콜라겐에 포함 된 인간 피부 섬유 아세포 (HDF)로 구성되어있다. 진피층에서 인간의 표피 각질 형성 세포 (HEK)은 시드입니다. 공기 – 액체 계면에서 2 주 이내에 HEK 여러 중요한 세포층과 각질층 이루어지는 표피를 구축. 이 모델의 생성 외에도,이 연구는 FTSE에 정의 된 정확한 상처를 만들 수있는 AWD를 사용하는 방법을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
시험 관내 세포에서 세포가 보통 플라스틱 표면에 부착하는 이차원 세포 배양 물에서 확장된다. 그러나 이러한 배양 조건은 세포가 생체 내에서 성장하는 생리 학적 입체 조건을 반영하지 않습니다. 입체 조건에서 세포는 자연 세포 – 세포 및 세포 – 매트릭스 첨부 파일을 형성 할 수 및 3 차원으로 이동한다. 세포 이동 및 행렬 생성은 상처 치유의 핵심 요소로서, 특히 생체 내 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank the Fraunhofer ISC for the collaboration concerning the construction of the automated wounding device. The project was founded by Fraunhofer internal project “Märkte von Übermorgen” (SkinHeal).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS | PAA | L11-003 | 0.05% |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid) | Produced in house | ||
| Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml) | Life Technologies | 33016-015 | |
| Inserts | Nunc | 140627 | |
| 6 well plate | Nunc | 140685 | |
| 24 well plate | Nunc | 142485 | |
| Microscope slides | R. Langenbrinck | 03-0070 | |
| Fibroblasts culturing (500 ml): | |||
| DMEM, high glucose | Life Technologies | 11965-092 | 89% (445 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 10% (50 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Keratinozyten culture medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | 89% (445 ml) |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Gel neutralization solution (250 ml): | |||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine | PAA | G0001,3010 | 93% (232,5 ml) |
| Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage | Sigma | C4384-1g | 1% (2,5 ml) |
| Fetal bovine serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 3% (7,5 ml) |
| HEPES | Sigma | H3375-1kg | 3% (7,5 ml) |
| Skin model submers medium (500ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | Promocell | C-20111 | |
| Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack | Promocell | C-39011 | |
| Fetal calf serum | Bio & Sell | FCS.ADD.0500 | 5%-2% (25 ml-10 ml) |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| Skin model air-liquid interface medium (500 ml): | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 | |||
| Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack | Promocell | C-39011 | adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | 1% (5 ml) |
| CaCl2 (300 mM) | Sigma | C7902-500g | 0,62% (3,1 ml) |
| Histology: | |||
| IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP | DCS | PD000KIT | |
| Vimentin antibody | Abcam | ab92547 | |
| CK14 antibody | Sigma | HPA023040-100µl | |
| CK10 antibody | Dako | M7002 | |
| Filaggrin antibody | Abcam | ab81468 | |
| H&E staining | |||
| Mayer´s Haemalaun | AppliChem | A0884,2500 | |
| Xylol | Sigma Aldrich | 296325-4X2L | |
| Ethanol | Sigma Aldrich | 32205-4X2.5L | |
| HCl | Sigma Aldrich | H1758-500ML | |
| Eosin | Sigma Aldrich | E4009-5G | |
| 2-Propanolol | Sigma Aldrich | I9516-500ML | |
| Mounting Medium | Sigma Aldrich | M1289-10ML |
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