Üç-boyutlu Tam Kalınlığı Deri Üretimi Eşdeğer ve Otomatik Yaralama

Summary

The goal of this protocol is to build up a three-dimensional full thickness skin equivalent, which resembles natural skin. With a specifically constructed automated wounding device, precise and reproducible wounds can be generated under maintenance of sterility.

Abstract

In vitro models are a cost effective and ethical alternative to study cutaneous wound healing processes. Moreover, by using human cells, these models reflect the human wound situation better than animal models. Although two-dimensional models are widely used to investigate processes such as cellular migration and proliferation, models that are more complex are required to gain a deeper knowledge about wound healing. Besides a suitable model system, the generation of precise and reproducible wounds is crucial to ensure comparable results between different test runs. In this study, the generation of a three-dimensional full thickness skin equivalent to study wound healing is shown. The dermal part of the models is comprised of human dermal fibroblast embedded in a rat-tail collagen type I hydrogel. Following the inoculation with human epidermal keratinocytes and consequent culture at the air-liquid interface, a multilayered epidermis is formed on top of the models. To study the wound healing process, we additionally developed an automated wounding device, which generates standardized wounds in a sterile atmosphere.

Introduction

Deri vücudun en büyük organıdır. Bu dış çevre ve iç organlar arasında bir bariyer oluşturur. Ayrıca, cilt sıvı kaybı, çevresel etkilere, yaralanma ve enfeksiyonlara karşı vücudu korur ve vücut ısısını ¹ düzenlemeye yardımcı olur. Nedeniyle açıkta bir konumda, cilt genellikle mekanik, termal veya kimyasal travma etkilenir. Cilt kendini tamir genellikle yetenekli olmasına rağmen, böyle bir enfeksiyon, oksijenlenme ve venöz yeterlilik gibi birden fazla yerel faktörler bozulmuş yara iyileşmesi yol açabilir. Yara iyileşmesi de obezite, alkolizm, sigara, ilaç, beslenme ve diyabet gibi hastalıklar gibi sistemik faktörler tarafından müdahale edilebilir. ²

(i) iltihaplı faz, (ii) proliferatif ve (iii) yeniden modelleme aşaması: yara iyileşmesi süreci 3 evreye ayrılabilir. Cilde hasar üzerine, karmaşık bir sinyal kademeli yara kapanmasına neden başlar. ³Yaralanma sonrası yara kanama ve bir kan pıhtısı meydana gelir. Fibroblastlar kan pıhtısı içine taşımak ve daha sonra yılda yenilenmiş yeni doku ile değiştirin.

Biyolojik süreçler altta yatan deri onarım mevcut anlayış sınırlıdır. Küçük hayvan ve domuz modelleri yara iyileşmesini incelemek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu sonuçlar, doğrudan türe özgü farklılıklar nedeniyle insanlarda transfer edilemez. Bu in vivo modellerde ek olarak, yara iyileşmesi bazı yönlerini ⁴ Bu çizilmeye modeller oldukça standardize edilir. Ölümsüzleştirdi hücre hatları veya primer hücrelerde dayalı in vitro tek tabaka kültürlerinin çizilmemesi yoluyla bir yara durumu taklit ederek ele alınabilir, ancak yeterince yansıtmıyor kompleks in vivo olarak fizyoloji. ^5, iki-boyutlu bir model yanı sıra, üç-boyutlu bir insan derisi eşdeğer dermatolojik araştırmaları için geliştirilmiştir. Bu modellerin dermal kısmı ge vardırnerated decellularized dermis, ⁶ kollajen hidrojeller, ^7,8 glikosaminoglikanlar ⁹ veya sentetik malzemelerden dahil olmak üzere çeşitli iskele kullanarak. ¹⁰ bu deri eşdeğerleri istihdam, epitelyal-mezenkimal etkileşimleri ¹¹ rolünü yeniden epitelizasyon, fibroblast ve keratinositler arasındaki hücresel karışma Farklı büyüme faktörlerinin etkisi incelenebilir. Ayrıca, bu modeller fibroblastlar yaralı bölgeye göç ve nasıl kemotaktik faktörler doku yenilenmesini nasıl etkilediği hakkında yeni bilgiler elde etmek için yararlıdır. ¹²

Yara iyileşmesi modelinin kendisinde değil, sadece üretim zor olmakla birlikte, aynı zamanda, bir modelde yüksek ölçüde standardize edilmiş yara sorunludur kurmak. Ortak teknikler yaralar çizik testleri, ¹³ yanıklara, ¹⁴ teyp aşınma, ¹⁵ termal yaralanma, ¹⁶ emme kabarcıklar, ¹⁷ sıvı azot, ¹⁸ lazerler, ¹⁹ olan oluşturmak için </sup> neşter, ¹⁸ meshers ⁶ ve biyopsi yumruklar. Bu yöntemlerin çoğu ²⁰ aynı tuzaklar var. Elle uygulanan yaralanmalar standartlaştırmak ve çoklu testler arasında yeniden zordur. Boyut, şekil ve yaranın derinliği çalışmalar arasında değişir ve böylece araştırma verilerinin kalitesini bozar. tanımlı cilt yaralanması için lazer kullanımı nispeten kolay standardize ancak yanık yaraları taklit bir duruma yol açar edilebilir. Lazer tarafından uygulanan ısı nekrotik dokunun yol açabilir protein denatürasyonu, trombosit agregasyonu veya damarların daralmasına neden olabilir.

Alternatif bir yaklaşımda, bize steril koşullar altında tanımlanmış ve hassas deri yaraları oluşturmak için izin veren bir otomatik yaralama cihazı (AWD) geliştirdi. Derinlik ve hız penetrasyonu olarak matkap ucu devir gibi yaralanması parametreleri ayarlanabilir. Bu çalışmada, biz evde geliştirilen tam kalınlıkta deri eşdeğerleri ile AWD kombine (ftGangatirkar ve arkadaşları tarafından yayınlanmış bir protokol ile karşılaştırılabilir SE). ⁸ deri eşdeğerinde dermal katman, hidrojel bir kollajen gömülü, insan dermal fibroblastları (HDF), oluşmaktadır. Dermal katmanda, insan epidermal keratinositler (HEK) numaralı seribaşı bulunmaktadır. Hava-sıvı arayüzü iki hafta içinde HEK birçok hayati hücre katmanları ve stratum corneum oluşan bir epidermis kurmak. Bu modelin oluşturmasının yanı sıra, bu çalışma FTSE tanımlanmış ve hassas yaralar oluşturmak üzere AWD kullanımını göstermektedir.

Protocol

NOT: protokol 24 tam kalınlıkta deri eşdeğerleri üretimi için tasarlanmıştır. Dermal fibroblastlar ve epidermal keratinositler İnsan 21,22 Aydınlatılmış onam önceden elde edildi. Daha önce yayınlanmış protokole göre deri biyopsi izole edilmiş ve çalışma Julius-Maximilians-Üniversitesi Würzburg insan araştırma kurumsal etik komitesi tarafından onaylanmıştır (182 oy / 10). Dermal Bileşeni 1. Üretimi 6 mg / ml'lik nihai bir konsantrasy…

Representative Results

izole edilmiş bir HDF ve HEK morfolojisinde ve tipik markerlerin ekspresyonu bakımından farklılık gösterir. Hek morfolojisi bir Arnavut kaldırımı morfolojisi ile tarif edilebilir ise Hdf, tipik mil-şekil morfolojisi gösterdi. Hücreler FTSE için bunları kullanmadan önce immünohistokimyasal boyama (Şekil 1) ile karakterize edilmiştir. Hdf vimentin (Şekil 1A), fibroblastlar için bir marker için olumludur. İlköğretim Hek derece erken farklılaşma proteini sitokerati…

Discussion

Nitro hücrelerde genellikle hücreler plastik yüzeylere yapışan iki boyutlu hücre kültürlerinde, yayılır. Bununla birlikte, bu kültür koşulları hücrelerinin in vivo büyümek olan fizyolojik üç boyutlu koşulları yansıtmamaktadır. Üç boyutlu koşulları altında, hücreler, doğal hücre-hücre ve hücre-matris bağlanmalarının ve üç boyutlu olarak yer değiştirmektedir. Hücre göçü ve matriks üretimi yara iyileşmesinin temel unsurları olarak özellikle in vivo …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Trypsin EDTA (1:250) 0.5 % in DPBS	PAA	L11-003	0.05%
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline	Sigma	D8537
Collagen (6 mg/ml in 0,1 % acetic acid)	Produced in house
Fibronectin Human Protein, Plasma (50 µg/ml)	Life Technologies	33016-015
Inserts	Nunc	140627
6 well plate	Nunc	140685
24 well plate	Nunc	142485
Microscope slides	R. Langenbrinck	03-0070
Fibroblasts culturing (500 ml):
DMEM, high glucose	Life Technologies	11965-092	89% (445 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	10% (50 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Keratinozyten culture medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111	89% (445 ml)
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Gel neutralization solution (250 ml):
Dulbecco’s Modified Eagle Medium, high Glucose Powder with L-Glutamine	PAA	G0001,3010	93% (232,5 ml)
Chondroitin sulfate sodium salt from shark cartilage	Sigma	C4384-1g	1% (2,5 ml)
Fetal bovine serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	3% (7,5 ml)
HEPES	Sigma	H3375-1kg	3% (7,5 ml)
Skin model submers medium (500ml):
Keratinocyte Growth Medium 2	Promocell	C-20111
Keratinocyte Growth Medium 2 SupplementPack	Promocell	C-39011
Fetal calf serum	Bio & Sell	FCS.ADD.0500	5%-2% (25 ml-10 ml)
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
Skin model air-liquid interface medium (500 ml):
Keratinocyte Growth Medium 2
Keratinocyte Growth Medium 2 Supplement Pack	Promocell	C-39011	adding only supplements: Insulin, Hydrocortisone, Epinephrine, Transferrin, CaCl2
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Life Technologies	15140-122	1% (5 ml)
CaCl2 (300 mM)	Sigma	C7902-500g	0,62% (3,1 ml)
Histology:
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP	DCS	PD000KIT
Vimentin antibody	Abcam	ab92547
CK14 antibody	Sigma	HPA023040-100µl
CK10 antibody	Dako	M7002
Filaggrin antibody	Abcam	ab81468
H&E staining
Mayer´s Haemalaun	AppliChem	A0884,2500
Xylol	Sigma Aldrich	296325-4X2L
Ethanol	Sigma Aldrich	32205-4X2.5L
HCl	Sigma Aldrich	H1758-500ML
Eosin	Sigma Aldrich	E4009-5G
2-Propanolol	Sigma Aldrich	I9516-500ML
Mounting Medium	Sigma Aldrich	M1289-10ML