تصور الأنسجة البين الستيرويدي المنشأ ولها المكروية الأوعية الدموية في الزرد
Summary
الغدة البين في الزرد هي نظيره teleostean من الغدة الكظرية الثدييات. يدخل هذا البروتوكول كيفية تنفيذ نازعة 3-β هيدروكسي ستيرويد (Δ 5-4 إيزوميراز، 3β-HSD) فحص النشاط الأنزيمي، الذي يكتشف خلايا الستيرويدي المنشأ متباينة في الزرد النامية.
Abstract
This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.
Introduction
الغدة الكظرية، عنصرا حاسما في المحور hypothalamo الغدة النخامية، الغدة الكظرية، تفرز المنشطات وينسق التوازن الستيرويد والاستجابة الجسدية للإجهاد. تتكون الغدة الكظرية القشرة الخارجية، التي تفرز المنشطات بطريقة منطقة محددة، والنخاع الداخلية، الذي يجمع الكاتيكولامينات. الغدة البين في teleosts هي النظير من الغدة الكظرية في الثدييات، وتتكون من خلايا البين وأليفة الكروم الستيرويدي المنشأ، والتي هي المعادل الوظيفي من قشرة الغدة الكظرية والنخاع، على التوالي 1-3. وأفادت الدراسات التي أجريت باستخدام نموذج الزرد التي تتشكل على حد سواء الأنساب الخلية الستيرويدي المنشأ وأليفة الكروم من الآليات الجزيئية والخلوية التي تشبه إلى حد كبير تلك الموجودة في الثدييات 1،2. ولذلك، فإن الزرد هو نموذج يحتمل أن تكون قوية لدراسة الأمراض الوراثية، ومراقبة الغدد الصم العصبية، وبيولوجيا الأنظمة من المحور hypothalamo الغدة النخامية، الغدة الكظرية (البين).
<p clasالصورة = "jove_content"> في الغدة الكظرية، 3β-HSD يحفز تحويل هرمون البروجسترون من بريغنينولون، 17α-هيدروكسي من 17α-hydroxypregnelolone، والاندروستيرون من ديهيدرو 4،5. 3β-HSD ضروري لbiosynthesizing جميع فئات المنشطات الهرمونية، وهما هرمون البروجسترون، السكرية، مستحضرات معدنية، الاندروجين، وهرمون الاستروجين. وهما البشري 3β-HSD نظائر الانزيمات HSD3B1 وHSD3B2 وأعرب تفاضلي 6. وأعرب عن HSD3B1 في المشيمة والأنسجة الطرفية، في حين أعرب HSD3B2 في قشرة الغدة الكظرية والغدد التناسلية. HSD3B1 الإنسان وHSD3B2 هي شارك في orthologs من hsd3b1 الزرد، وهو ما يعبر عنه في الأنسجة البين والغدد التناسلية الكبار. hsd3b2 الزرد هو جين أعرب أمومي التي تختفي قبل توالد 7 النصوص. وقد تم تطوير هذا البروتوكول من 3β-HSD فحص النشاط الأنزيمي كامل جبل لالزرد عن طريق تعديل طريقة ليفي، وهوق التي وصفها ميلانو وآخرون. ، على أقسام المجمدة من ثمانية أنواع مكتملة العظام 8. بسبب نفاذية الأنسجة والشفافية البصرية من الزرد النامية، كلها جبل 3β-HSD الكيمياء النسيجية يمكن أن تستخدم بنجاح للجنين الزرد ثابت واليرقات وتحديدا ترسيم أنسجة البين متباينة.وقد تم تطبيق هذا الاختبار حساس وسريع لمختلف المسوخ وmorphants مما يدل على أنواع مختلفة من dysmorphogenesis بين الكليتين. النشاط 3β-HSD البين غائب في الجنين حيث تعطلت مواصفات الأنسجة البين من خلال ضربة قاضية محددة من عامل النسخ Ff1b وانخفضت كما يتأثر التمايز البين من قبل ضربة قاضية للcoregulator Ff1b Prox1 9،10. والجدير بالذكر، أن يتم الكشف عن النشاط 3β-HSD في المسوخ مع عيوب مرحلة مبكرة شديدة، مثل أعور رأس الدبوس والحول، حيث 3β-Hالتنمية المستدامة الكيمياء النسيجية يحدد كيف يتأثر الهجرة الخلية البين 11. عدم المساس تمايز الأنسجة البين حتى في غياب كامل من الدم والأوعية الدموية. لذلك، كيف ترسم إشارات المستمدة من البطانة الجهاز البين وضع يمكن تحديد 12،13. وبشكل عام، وقد استخدم هذا الاختبار بنجاح النسيجية لدراسة مواصفات، والتمايز، وهجرة الخلايا الستيرويدي المنشأ في نموذج الزرد. لذلك، يجب أن تكون فعالة وأداة يمكن الاعتماد عليها لأي شاشات الوراثية أو الكيميائية التي تستهدف اضطرابات الجهاز الكظرية والبين.
Protocol
Representative Results
Discussion
زادت قوة الإشارة من النشاط 3β-HSD على مدى رد فعل. تم الكشف عن إشارات واضحة عن النشاط 3β-HSD بعد 4 ساعات من رد فعل لمراحل من 28 HPF فصاعدا. ومع ذلك، ومدة رد الفعل يتطلب تحديد التجريبية، وهذا يتوقف على الغرض من الفحص. في الحالات التي يتطلب تلطيخ معالجة بين عشية وضحاها، على خلفية م…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر البروفيسور كريستوف Englert والبروفيسور ديدييه Stainier لالإهداء تيراغرام (wt1b: GFP) li1 وتيراغرام (kdrl: EGFP) s843 سلالات، على التوالي، ومرفق تايوان الزرد الأساسية لتوفير تيراغرام (kdrl: mCherry) CI5. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من وزارة تايوان للعلوم والتكنولوجيا (96-2628-B-029-002-MY3، 101-2313-B-029-001، 102-2628-B-029-002-MY3، 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Glycerol | USB | US16374 |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 |
| Tween 20 | Sigma | P9416 |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
- To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
- Liu, Y. W. Interrenal organogenesis in the zebrafish model. Organogenesis. 3, 44-48 (2007).
- Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
- Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
- Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
- Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
- Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
- Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
- Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
- Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
- Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
- Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).
