La visualización del Tejido Interrenal androgénica, y su microambiente vascular en el pez cebra
Summary
La glándula interrenal en el pez cebra es la contraparte teleósteos de la glándula adrenal de los mamíferos. Este protocolo presenta cómo realizar la deshidrogenasa 3-β-hidroxiesteroide (Δ 5-4 isomerasa; 3β-HSD) ensayo de actividad enzimática, que detecta las células esteroidogénicas diferenciadas en el pez cebra en desarrollo.
Abstract
This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.
Introduction
La glándula suprarrenal, un componente crucial del eje hipotálamo-pituitario-adrenal, segrega esteroides y coordina la homeostasis de esteroides y la respuesta del cuerpo al estrés. La glándula suprarrenal comprende la corteza exterior, que segrega los esteroides de manera-zona específica, y médula interna, que sintetiza las catecolaminas. La glándula interrenal en teleósteos es la contraparte de la glándula suprarrenal en los mamíferos y se compone de células cromafines interrenal y androgénica, que son equivalentes funcionales de la corteza suprarrenal y la médula, respectivamente 1-3. Estudios llevados a cabo utilizando el modelo de pez cebra han informado de que los dos linajes de células esteroidogénicas y cromafines se forman por los mecanismos moleculares y celulares altamente parecidas a las de los mamíferos 1,2. Por lo tanto, el pez cebra es un modelo potencialmente poderosa para el estudio de enfermedades genéticas, el control neuroendocrino, y la biología de sistemas del eje hipotálamo-pituitario-adrenal (interrenal).
<p class = "jove_content"> En la glándula adrenal, 3β-HSD cataliza la conversión de la progesterona a partir de pregnenolona, 17α-hidroxiprogesterona de 17α-hydroxypregnelolone, y la androstenediona de dehidroepiandrosterona 4,5. 3β-HSD es esencial para la biosíntesis de todas las clases de esteroides hormonales, a saber, la progesterona, glucocorticoides, mineralocorticoides, andrógenos y estrógenos. Los dos humana 3β-HSD isoenzimas hsd3b1 y HSD3B2 se expresan diferencialmente 6. Hsd3b1 se expresa en la placenta y en los tejidos periféricos, mientras que HSD3B2 se expresa en la corteza adrenal y las gónadas. Hsd3b1 humana y HSD3B2 son co-orthologs de hsd3b1 pez cebra, que se expresa en el tejido interrenal gónadas y adultos; HSD3B2 pez cebra es un gen expresado maternalmente cuyas transcripciones desaparecer antes de la organogénesis 7. El protocolo de todo el montaje en el ensayo de actividad enzimática 3β-HSD para el pez cebra fue desarrollado modificando el método de Levy,s descrito por Milano et al. , En secciones congeladas de ocho especies de teleósteos 8. Debido a la permeabilidad del tejido y la transparencia óptica del pez cebra en desarrollo, todo el montaje 3β-HSD la histoquímica se puede utilizar con éxito para el embrión del pez cebra fija y larvas y específicamente delinear los tejidos interrenal diferenciadas.Este ensayo sensible y rápido se ha aplicado a diversos mutantes y morphants que demuestran diferentes tipos de dysmorphogenesis interrenal. La actividad 3β-HSD interrenal está ausente en el embrión, donde la especificación del tejido interrenal se interrumpe a través de una caída específica del factor de transcripción ff1b y se disminuyó a medida que la diferenciación interrenal se ve afectada por una caída de la coregulator ff1b Prox1 9,10. En particular, la actividad 3β-HSD se puede detectar en los mutantes con defectos severos en fase inicial, tales como una cabeza de alfiler de ojos y estrabismo, donde el 3β-Hhistoquímica sd delinea cómo la migración de las células se ve afectado interrenal 11. La diferenciación del tejido interrenal no se vea comprometida incluso en ausencia completa de la sangre y la vasculatura. Por lo tanto, cómo las señales derivadas del endotelio forma al órgano interrenal en desarrollo puede ser determinada 12,13. En general, este ensayo histoquímico ha sido utilizado con éxito para el estudio de la especificación, diferenciación y migración de las células esteroidogénicas en el modelo de pez cebra. Por lo tanto, debe ser un una herramienta fiable para todas las pantallas genéticas o químicas dirigidas a trastornos de los órganos suprarrenales y interrenal eficiente y.
Protocol
Representative Results
Discussion
La intensidad de la señal de la actividad 3β-HSD aumentó durante el curso de la reacción. se detectaron señales claras de la actividad 3β-HSD después de 4 horas de reacción para las etapas de 28 hpf en adelante. Sin embargo, la duración de la reacción requiere la determinación empírica, dependiendo de la finalidad del ensayo. En los casos en que la tinción requiere procesamiento durante la noche, un fondo ligeramente azulado tiende a desarrollarse en las muestras. Este problema se puede superar mediante el …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos al Prof. Christoph Englert y el Prof. Didier Stainier para regalar la Tg (wt1b: GFP) LI1 y Tg (kdrl: EGFP) s843 cepas, respectivamente, y el Fondo para el pez cebra Taiwán Core para proporcionar Tg (kdrl: mCherry) CI5. Este estudio fue apoyado por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Tecnología (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3 de Taiwán, 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Glycerol | USB | US16374 |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 |
| Tween 20 | Sigma | P9416 |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
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