Visualisierung der Interrenal- Steroidogenic Gewebe und seine Vascular Mikromilieu in Zebrabärbling
Summary
Die Interrenal- Drüse in Zebrabärbling ist die Teleosteer Pendant der Säugetiernebenniere. Dieses Protokoll führt , wie das 3-β-Hydroxysteroid – Dehydrogenase (Δ 5-4 Isomerase; 3β-Hsd) zur Durchführung enzymatischer Aktivitätstest, der differenzierte steroidogenen Zellen in der Entwicklungs Zebrabärbling erkennt.
Abstract
This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.
Introduction
Die Nebenniere, eine entscheidende Komponente des Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren-Achse, sondert Steroide und koordiniert Steroid-Homöostase und die körperliche Reaktion auf Stress. Die Nebenniere besteht aus der äußeren Rinde, die Steroide in einer Zone spezifisch und innere Medulla, die Katecholamine synthetisiert absondert. Die Interrenal- Drüse in teleosts ist das Gegenstück der Nebenniere bei Säugetieren und ist steroidogenen Interrenal- und chromaffinen Zellen zusammengesetzt aus, die funktionale Äquivalente der Nebennierenrinde und Medulla sind jeweils 1-3. Studien mit der Zebrabärbling – Modell durchgeführt , haben berichtet , dass beide steroidogenen und chromaffinen Zelllinien von molekularen und zellulären Mechanismen gebildet sind ähnlich denen hoch in Säugetieren 1,2. Daher ist der Zebrabärbling ein potenziell leistungsfähiges Modell für genetische Erkrankungen zu studieren, neuroendokrinen Kontrolle und Systembiologie des Hypothalamus-Hypophysen-Nebennieren (Interrenal-) Achse.
<p class = "jove_content"> in der Nebenniere, 3β-Hsd katalysiert die Umwandlung von Progesteron aus Pregnenolon, 17α-Hydroxyprogesteron aus 17α-hydroxypregnelolone und Androstendion aus Dehydroepiandrosteron 4,5. 3β-HSD wichtig, alle Klassen der hormonellen Steroide für die Biosynthese, nämlich Progesteron, Glucocorticoide, Mineralocorticoiden, Androgene und Östrogene. Die beiden menschlichen 3β HSD Isoenzyme HSD3B1 und HSD3B2 sind differentiell exprimiert 6. HSD3B1 wird in der Plazenta und peripheren Geweben exprimiert, während HSD3B2 in der Nebennierenrinde und Gonaden exprimiert wird. Menschliche HSD3B1 und HSD3B2 co-Orthologe von Zebrabärbling hsd3b1, die am Interrenal- Gewebe und adulte Gonaden exprimiert wird; Zebrabärbling hsd3b2 ist ein maternal exprimierte Gen , dessen Transkripte verschwinden vor organogenesis 7. Das Protokoll des gesamten Montage 3β-Hsd enzymatischen Aktivitätstest für Zebrabärbling durch Modifizieren Levy-Verfahren entwickelt wurde, eins von Milano et al. , Auf Gefrierschnitten von acht Teleostier Arten 8. Aufgrund der Gewebedurchlässigkeit und optische Transparenz der Entwicklungs Zebrabärbling, Vollmontage 3β-Hsd Histochemie kann erfolgreich für die feste Zebrafischembryo und Larven und speziell die differenzierten Interrenal- Gewebe abzugrenzen verwendet werden.Dieses empfindliche und schnelle Assay wurde auf verschiedenen Mutanten und morphants angewendet wurden verschiedene Arten von Interrenal- dysmorphogenesis demonstriert. Die Interrenal- 3β -HSD – Aktivität im Embryo abwesend wo Spezifikation des Interrenal- Gewebe durch eine bestimmte Zuschlags des FF1b Transkriptionsfaktor gestört ist und verringert so die Interrenal- Differenzierung durch eine Zuschlags des FF1b coregulator Prox1 9,10 betroffen ist. Bemerkenswert ist , kann der 3β-HSD in Mutanten mit schweren frühzeitig Defekte wie einäugige Stecknadelkopf und schielen, wo der 3β-H detektiert werdensd histochemistry umreißt , wie die Interrenal- Zellmigration 11 betroffen. Die Differenzierung des Interrenal- Gewebe wird nicht einmal in der vollständigen Abwesenheit von Blut und Vaskulatur kompromittiert. Deshalb, wie Endothel-abgeleiteten Signale die Entwicklung Interrenal- Organ formen kann 12,13 bestimmt werden. Insgesamt ist dieser histochemischen Assay zur Untersuchung der Spezifikation, Differenzierung und Migration von steroidogenen Zellen im Zebrafisch Modell erfolgreich verwendet wurde. Daher sollte ein effizientes und zuverlässiges Werkzeug für jede genetische oder chemische Bildschirme Targeting Nebennieren- und Interrenal- Organstörungen sein.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Signalstärke des 3β -HSD-Aktivität erhöht sich im Laufe der Reaktion. Klare Signale der 3β-HSD wurden nach 4 Stunden Reaktions für die Stufen von 28 HPF weiter erkannt. Jedoch erfordert die Reaktionsdauer empirische Bestimmung, abhängig von dem Zweck des Assays. In Fällen, in denen die Färbung über Nacht Verarbeitung erfordert, neigt eine leicht bläuliche Hintergrund auf den Proben zu entwickeln. Dieses Problem kann durch Erhöhen der Fixationsdauer (beispielsweise 4 Stunden in 4% PFAT bei RT) vo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Prof. Christoph Englert und Prof. Didier Stainier zum Verschenken der Tg (wt1b: GFP) LI1 und Tg (kdrl: EGFP) S843 Stämme sind, und die Taiwan Zebrabärbling Core Facility für die Bereitstellung von Tg (kdrl: mCherry) CI5. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Taiwan Ministerium für Wissenschaft und Technologie (96-2628-B-029-002-MY3, unterstützt 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Glycerol | USB | US16374 |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 |
| Tween 20 | Sigma | P9416 |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
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