לדמיין את רקמות Interrenal Steroidogenic ו microenvironment הדם שלה דג הזברה
Summary
בלוטת interrenal דג הזברה היא עמיתו teleostean של בלוטת יותרת הכליה היונקת. פרוטוקול זה מציג כיצד לבצע את dehydrogenase 3-β-hydroxysteroid (איזומראז Δ 5-4; 3β-HSD) assay הפעילות האנזימטית, אשר מזהה תאים steroidogenic הבדיל של דג הזברה פיתוח.
Abstract
This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.
Introduction
בלוטת יותרת הכליה, מרכיב חיוני של ציר hypothalamo-היפופיזה-אדרנל, מפריש סטרואידים ומתאם הומאוסטזיס סטרואידים ואת התגובה הגופנית ללחץ. בלוטת יותרת הכליה כולל הקורטקס החיצוני, אשר מפריש סטרואידים באופן אזור ספציפי, ומדולה פנימית, אשר מסנתז קטכולאמינים. בלוטת interrenal ב teleosts היא העמית של בלוטת יותרת הכליה ביונקים והוא מורכב של תאי interrenal ו chromaffin steroidogenic, שהן ושווי תפקודי של קליפת יותרת הכליה ומדולה, בהתאמה 1-3. מחקרים שנערכו תוך יישום מודל דג הזברה דיווחו כי הן שושלות תאים steroidogenic ו chromaffin נוצרות על ידי מנגנונים מולקולריים ותאיים מאוד דומים לאלה ביונקים 1,2. לכן, דג הזברה הוא מודל רב עצמה פוטנציאלית ללימוד הפרעות גנטיות, בקרת נוירואנדוקריניים, וביולוגית מערכות של hypothalamo-היפופיזה-אדרנל הציר (interrenal).
<p class = "jove_content"> בבלוטת יותרת הכליה, 3β-HSD מזרז את ההמרה של פרוגסטרון מ פרגננולון, 17α-hydroxyprogesterone מ 17α-hydroxypregnelolone, ו אנדרוסטנדיון מ dehydroepiandrosterone 4,5. 3β-HSD חיונית biosynthesizing כל המעמדות של סטרואידים הורמונלית, כלומר פרוגסטרון, גלוקוקורטיקואידים, מינרלוקורטיקואידים, אנדרוגנים, אסטרוגנים. שני-HSD 3β האדם isozymes HSD3B1 ו HSD3B2 מבוטא 6 דיפרנציאלי. HSD3B1 מתבטא השליה ורקמות פריפריה, כאשר HSD3B2 מתבטא בקליפת והאשכים הכליה. האדם HSD3B1 ו HSD3B2 הוא-orthologs שיתוף של hsd3b1 דג הזברה, אשר באו לידי ביטוי על רקמות interrenal ואשכים מבוגרים; hsd3b2 דג הזברה הוא גן אימהי הביע שאת התמלילים להיעלם לפני organogenesis 7. הפרוטוקול של assay הפעילות האנזימטית כל הר 3β-HSD עבור דג זברה פותח על ידי שינוי השיטה של לוי,שעות שתואר על ידי Milano et al. , על חלקים קפואים של שמונה בעלי חוליות 8. בגלל חדירות רקמות שקיפות אופטית של דג הזברה פיתוח, כל הר 3β-HSD היסטוכימיה יכול לשמש בהצלחה העובר הזחלים דג הזברה קבוע ובאופן ספציפי להתוות הרקמות interrenal מובחן.assay הרגיש ומהיר זו יושם כדי מוטנטים morphants שבאו להפגין סוגים שונים של dysmorphogenesis interrenal. פעילות interrenal 3β-HSD תיאור בעובר שבו מפרט של רקמת interrenal מופר באמצעות מציאה ספציפית של גורם שעתוק Ff1b והוא ירד כמו הבידול interrenal מושפע מציאה של coregulator Ff1b Prox1 9,10. יש לציין, כי פעילות 3β-HSD ניתן לאתר מוטציות עם מומים בשלב מוקדם חמורים, כגון ראש סיכת שתום עין לפזול, שבו 3β-Hsd היסטוכימיה מתווה כיצד נדידת תאי interrenal מושפעת 11. הבידול של רקמת interrenal לא נפגע גם בהיעדר המוחלט של דם בכלי דם. לכן, איך אותות שמקורם האנדותל לעצב את איבר interrenal בפיתוח ניתן לקבוע 12,13. בסך הכל, assay histochemical זה שימש בהצלחה ללימוד מפרט, בידול, והגירה של תאים steroidogenic במודל דג הזברה. לכן, זה צריך להיות יעיל כלי אמין עבור כל מסך גנטי או כימי מיקוד הפרעות איבר האדרנל interrenal.
Protocol
Representative Results
Discussion
עוצמת האות של פעילות 3β-HSD וגובר במהלך ריאקציה. אותות ברורים של פעילות 3β-HSD אותרו לאחר 4 שעות של התגובה לשלבים מ -28 hpf ואילך. עם זאת, משך התגובה דורש נחישות אמפירית, בהתאם לצורך של assay. במקרים בהם מכתים דורש עיבוד לילה, רקע כחלחל מעט נוטה להתפתח על דגימות. ניתן להתגבר על בעי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים פרופ 'כריסטוף אנגלר ופרופ דידייה Stainier עבור gifting את Tg (wt1b: GFP) Li1 ו Tg (kdrl: EGFP) s843 זנים, בהתאמה, ואת מתקן Core דג הזברה טייוואן למתן Tg (kdrl: mCherry) ci5. מחקר זה נתמך על ידי מענקי משרד של טייוואן המדע והטכנולוגיה (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Glycerol | USB | US16374 |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 |
| Tween 20 | Sigma | P9416 |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
- Hsu, H. J., Lin, G., Chung, B. C. Parallel early development of zebrafish interrenal glands and pronephros: differential control by wt1 and ff1b. Development. 130, 2107-2116 (2003).
- To, T. T., et al. Pituitary-interrenal interaction in zebrafish interrenal organ development. Mol Endocrinol. 21, 472-485 (2007).
- Liu, Y. W. Interrenal organogenesis in the zebrafish model. Organogenesis. 3, 44-48 (2007).
- Cravioto, M. D., et al. A new inherited variant of the 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase-isomerase deficiency syndrome: evidence for the existence of two isoenzymes. J Clin Endocrinol Metab. 63, 360-367 (1986).
- Lachance, Y., et al. Characterization of human 3 beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta 5-delta 4-isomerase gene and its expression in mammalian cells. J Biol Chem. 267, 3551 (1992).
- Simard, J., et al. Molecular biology of the 3beta-hydroxysteroid dehydrogenase/delta5-delta4 isomerase gene family. Endocr Rev. 26, 525-582 (2005).
- Lin, J. C., et al. Two zebrafish hsd3b genes are distinct in function, expression, and evolution. Endocrinology. 156, 2854-2862 (2015).
- Grassi Milano, E., Basari, F., Chimenti, C. Adrenocortical and adrenomedullary homologs in eight species of adult and developing teleosts: morphology, histology, and immunohistochemistry. Gen Comp Endocrinol. 108, 483-496 (1997).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev Biol. 260, 226-244 (2003).
- Liu, Y. W., Gao, W., Teh, H. L., Tan, J. H., Chan, W. K. Prox1 is a novel coregulator of Ff1b and is involved in the embryonic development of the zebra fish interrenal primordium. Mol Cell Biol. 23, 7243-7255 (2003).
- Chai, C., Liu, Y. W., Chan, W. K. Ff1b is required for the development of steroidogenic component of the zebrafish interrenal organ. Dev. Biol. 260, 226-244 (2003).
- Chou, C. W., Zhuo, Y. L., Jiang, Z. Y., Liu, Y. W. The hemodynamically-regulated vascular microenvironment promotes migration of the steroidogenic tissue during its interaction with chromaffin cells in the zebrafish embryo. PLoS One. 9, e107997 (2014).
- Liu, Y. W., Guo, L. Endothelium is required for the promotion of interrenal morphogenetic movement during early zebrafish development. Dev Biol. 297, 44-58 (2006).
- Jin, S. W., Beis, D., Mitchell, T., Chen, J. N., Stainier, D. Y. Cellular and molecular analyses of vascular tube and lumen formation in zebrafish. Development. 132, 5199-5209 (2005).
- Proulx, K., Lu, A., Sumanas, S. Cranial vasculature in zebrafish forms by angioblast cluster-derived angiogenesis. Dev Biol. 348, 34-46 (2010).
- Perner, B., Englert, C., Bollig, F. The Wilms tumor genes wt1a and wt1b control different steps during formation of the zebrafish pronephros. Dev Biol. 309, 87-96 (2007).
- Chou, C. W., Chiu, C. H., Liu, Y. W. Fibronectin mediates correct positioning of the interrenal organ in zebrafish. Dev Dyn. 242, 432-443 (2013).
- Chiu, C. H., Chou, C. W., Takada, S., Liu, Y. W. Development and fibronectin signaling requirements of the zebrafish interrenal vessel. PLoS One. 7, e43040 (2012).
