Visualiser le tissu interrénal stéroïdogénique et son vasculaire Microenvironnement dans Zebrafish
Summary
La glande interrénal chez le poisson zèbre est la contrepartie téléostéen de la glande surrénale chez les mammifères. Ce protocole présente comment effectuer la déshydrogénase 3-β-hydroxystéroïde (Δ 5-4 isomérase; 3β-HSD) dosage de l' activité enzymatique, qui détecte les cellules stéroïdogènes différenciées chez le poisson zèbre en développement.
Abstract
This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-β-Hydroxysteroid dehydrogenase /Δ5-4 isomerase (3β-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3β-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3β-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.
Introduction
La glande surrénale, un élément crucial de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien, sécrète stéroïdes et coordonne l'homéostasie des stéroïdes et la réponse du corps au stress. La glande surrénale comprend le cortex externe, qui sécrète des stéroïdes d'une manière spécifique de la zone, et la médulla interne, qui synthétise catécholamines. La glande interrénal en téléostéens est la contrepartie de la glande surrénale chez les mammifères et est composé de cellules interrénales et chromaffines stéroïdogenèse, qui sont des équivalents fonctionnels du cortex surrénalien et de la moelle, respectivement 1-3. Des études réalisées en utilisant le modèle de poisson zèbre ont rapporté que les deux lignées de cellules chromaffines stéroïdogenèse et sont formées par des mécanismes moléculaires et cellulaires très semblables à ceux des mammifères 1,2. Par conséquent, le poisson zèbre est un modèle potentiellement puissant pour l'étude des troubles génétiques, le contrôle neuroendocrine, et la biologie des systèmes de l'axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (interrénal).
<p class = "jove_content"> Dans la glande surrénale, 3β-HSD catalyse la conversion de la progestérone à partir de prégnénolone, 17α-hydroxyprogestérone , de la 17α-hydroxypregnelolone et de l' androstènedione déhydroépiandrostérone 4,5. 3β-HSD est essentiel pour la biosynthèse toutes les classes de stéroïdes hormonaux, à savoir la progestérone, les glucocorticoïdes, les minéralocorticoïdes, les androgènes et oestrogènes. Les deux 3β-HSD humaine isoenzymes HSD3B1 et HSD3B2 sont exprimés de manière différentielle 6. HSD3B1 est exprimée dans le placenta et les tissus périphériques, tandis que HSD3B2 est exprimée dans le cortex surrénal et les gonades. HSD3B1 humaine et HSD3B2 sont co-orthologues de HSD3B1 zebrafish, qui est exprimé au niveau du tissu interrénal et les gonades adultes; hsd3b2 zebrafish est un gène maternellement exprimé dont les transcriptions disparaître avant organogenèse 7. Le protocole de l'ensemble de montage 3β-HSD dosage d'activité enzymatique pour le poisson zèbre est développé en modifiant la méthode de Levy,s décrite par Milano et al. , Sur des coupes congelées de huit espèces de téléostéens 8. En raison de la perméabilité du tissu et de la transparence optique du poisson zèbre développement, l'ensemble du montage 3β-HSD histochimie peut être utilisé avec succès pour l'embryon de poisson zèbre fixe et les larves, et plus particulièrement à délimiter les tissus différenciés interrénales.Ce dosage rapide et sensible a été appliquée à divers mutants et morphants montrent différents types de dysmorphogenèse interrénal. L'activité 3β-HSD interrénal est absent dans l'embryon , où la spécification du tissu interrénal est perturbé par un effet de choc spécifique du facteur de transcription Ff1b et diminue à mesure que la différenciation interrénal est affectée par un effet de choc de la co – régulateur Ff1b Prox1 9,10. Notamment, l'activité 3β-HSD peuvent être détectés chez des mutants présentant des défauts graves à un stade précoce, comme borgnes tête d' épingle et strabisme, où le 3β-Hsd histochimie définit la façon dont la migration cellulaire interrénal est affectée 11. La différenciation du tissu interrénal ne soit pas compromise, même en l'absence complète de sang et le système vasculaire. Par conséquent, comment les signaux de endothéliale façonnent l'organe interrénal développement peut être déterminé 12,13. Dans l'ensemble, cette analyse histochimique a été utilisé avec succès pour l'étude de la spécification, la différenciation et la migration des cellules stéroïdogènes dans le modèle de poisson zèbre. Par conséquent, il devrait être un moyen efficace et un outil fiable pour tous les écrans génétiques ou chimiques ciblant les troubles des organes surrénales et interrénales.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'intensité du signal de l'activité 3β-HSD a augmenté au cours de la réaction. Des signaux clairs de l'activité 3β-HSD ont été détectées après 4 heures de réaction pour les étapes à partir de 28 HPF en avant. Toutefois, la durée de la réaction nécessite la détermination empirique, en fonction du but de l'essai. Dans le cas où la coloration nécessite un traitement pendant une nuit, un fond légèrement bleutée tend à se développer sur les échantillons. Ce problème peut être surm…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Prof. Christoph Englert et le Professeur Didier Stainier pour les dons de la Tg (wt1b: GFP) li1 et Tg (kdrl: EGFP) S843 souches, respectivement, et la facilité de Taiwan Zebrafish de base pour fournir Tg (kdrl: mCherry) CI5. Cette étude a été soutenue par des subventions du ministère de Taiwan de la science et de la technologie (96-2628-B-029-002-MY3, 101-2313-B-029-001, 102-2628-B-029-002-MY3, 102- 2321-B-400-018).
Materials
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM510 |
| DMSO | Sigma | D8418 |
| Glycerol | USB | US16374 |
| Hyclone Fetal Calf Serum | GE Healthcare Life Sciences | SH30073 |
| Nicotinamide | Sigma | N0636 |
| β-Nicotinamide adenine dinucleotide hydrate | Sigma | N1636 |
| 4-Nitro blue tetrazolium | Promega | S380C |
| Nusieve GTG | Lonza | 50081 |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 |
| Phenylthiourea | Sigma | P7629 |
| Phosphate buffered saline | Sigma | P4417-100Tab |
| PYREX Spot Plate | Corning | 7220-85 |
| Reef Salt | AZOO | AZ28001 |
| trans-Dehydroandrosterone | Sigma | D4000 |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 |
| Tween 20 | Sigma | P9416 |
| Vibratome | Leica | VT1000M |
References
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