Introduction
والثدييات الشق يشير المسار هو مثلي إلى نفس المسار في ذبابة الفاكهة، ويتكون من أربعة مستقبلات الغشاء الشق (Notch1-4) وخمسة بروابط بغشاء من خشنة (JAG1 وJAG2) ودلتا مثل (DLL1، 3، & 4) أسر 1. يبدأ الشق الإشارات عندما يرتبط مستقبلات درجة على خلية المستقبلة التي يجند على خلية يحيل 2. خلال هذا التنشيط عبر والشق يجند بغشاء ينتج قوة تمتد على بغشاء الشق مستقبلات 3 و 4. القوة تمتد من يجند ملزم يؤدي الى تغييرات بتكوين في مستقبلات الشق التي تسهل انشقاق خارج الخلية من المستقبلات التي كتبها TNFalpha تحويل انزيم (TACE)، يليه حدث انشقاق داخل الخلايا بوساطة التي تحتوي على presenilin جاما secretase معقدة (γ-secretase). النشرات γ-secretase كثافة العمليات الشقنطاق racellular حوال التي translocates داخل النواة حيث يشكل مجمع تفعيل النسخي مع البرازيلي-1-سو (H) -Lag-1 (CSL)، العقل المدبر مثل (MAML)، وخلية العوامل نوع معين لدفع التعبير استهداف الجينات 5.
العناصر الميكانيكية الشق يشير نتيجة التنشيط في الحاجة إلى أساليب فريدة من تفعيل الشق المسار في المختبر. يمكن بروابط الشق القابلة للذوبان ربط الشق المستقبلات، لكنه يفشل في إنتاج تمتد القوات اللازمة للافراج حوال وفي الوقت نفسه تثبيط تنافسية ملزمة بروابط الشق المرتبط الخلية. وهكذا، إضافة بروابط الشق القابلة للذوبان في ثقافة المتوسط يمكن أن تخفف الشق الطبيعي يشير 6 و 7. لحسن الحظ، يمكن بروابط الشق لحث على الإفراج حوال إذا كانت ثابتة على ركيزة صلبة مناسبة 5، 8، 9،10. بذر الخلايا على ركائز الثقافة المغلفة يجند أو تطبيق حبات المغلفة يجند إلى الخلايا على حد سواء يمكن تفعيل الشق الإشارات، والاختيار بينها يعتمد في المقام الأول على توقيت المطلوب من التحفيز الشق. لتفعيل الشق يشير فوري، مؤقت، كما هو المطلوب خلال منتصف فحص وظيفي أو التمايز، يجند الشق يمكن أن تكون ملزمة لالاغاروز الخرز، وتطبيقها على الخلايا المستزرعة، وجرفت في أي وقت. لمزيد من الإشارات الشق متواصلة من بداية الفترة الثقافة، لوحات زراعة الأنسجة يمكن أن تكون مغلفة مع يجند قبل البذر الخلية.
لأغراض هذا البروتوكول، ويتم تنفيذ طرق من استخدام السلائف الماوس ناقضة العظم، ولكن الأساليب والاختلافات على الطرق الموضحة هنا تنطبق على مجموعة واسعة من أنواع الخلايا 6، 11، 12، 13، 14. الآكلة هي عضال متباينة الخلايا المكونة للدم عدد الأسطر التي هي المسؤولة عن ارتشاف النسيج العظمي، وكانوا متورطين في الاضطرابات متعددة من فقدان العظام (15). وهكذا، الدراسة في المختبر من تمايز الخلايا الآكلة من السلائف الوحيدات / بلعم-نسبهم والآليات الجزيئية التي تتحكم في وظيفتها هي ضرورية لفهم أفضل للالآكلة وتطوير علاجات جديدة لتجديد العظام. في حين اصبح من المقبول عموما أن يشير الشق تلعب دورا إيجابيا في التمايز وظيفة الخلايا الآكلة، والاختلافات في كل من التحفيز يشير الشق وناقضة العظم ثقافة السلائف والتمايز أدى إلى البداية النتائج المتناقضة 16، 17، 18، 19. دراسة أعمق للاختلافات في طرق واستخدام الوراثيةنماذج قد أوضح كثيرا من دور الإشارات الشق في osteoclastogenesis، ولكن تطبيق أساليب التحفيز الشق وثقافة موحدة يمكن منع مثل هذه الخلافات في الدراسات المستقبلية من الإشارات الشق في أنواع الخلايا الأخرى 20، 21، 22، 23.
وهناك طرق متعددة لزراعة والتفريق السلائف الماوس ناقضة العظم، وكما هو الحال مع طرق مختلفة لتحفيز الشق إشارة، فإن أفضل طريقة تعتمد على مسألة تجريبية. هنا، سيتم تقديم أسلوبنا المفضل للزراعة كسور ملتصقة وغير ملتصقة من خلايا نخاع العظام مسح من الماوس طويلة. هذا الأسلوب له ميزة تتطلب في الأساس ليست معدات متخصصة وإنتاج الخلايا التي تنطبق على مجموعة متنوعة من الطرق التقليدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إجراء كافة البحوث التي تنطوي على الحيوانات الفقارية وفقا للبروتوكولات المعتمدة من قبل جامعة ولاية بنسلفانيا رعاية الحيوان المؤسسية واللجنة الاستخدام (IACUC).
1. إعداد وسائل الإعلام الثقافة
- إعداد ألفا-MEM عن طريق إذابة الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) مسحوق و 1.9 غرام بيكربونات الصوديوم في 900 مل H 2 O وتكملة مع 2 مم L-الجلوتامين، و 100 وحدة / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، و 100 مل للحرارة المعطل الجنين المصل البقري. تعقيم باستخدام فلتر 0.22 ميكرون polyethersulfone (PES).
- إعداد المتوسطة البلاعم التي كتبها المكمل ألفا-MEM مع 35 نانوغرام / مل المؤتلف الماوس بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF)
- إعداد المتوسطة ناقضة العظم من خلال استكمال المتوسطة بلعم مع 100 نانوغرام / مل RANKL
2. نخاع العظم عزل الخلايا
- ملء واحدة حقنة 10 مل مع إبرة 25⅝ قياس في الماوس مع 10 مل α-MEM. الموت ببطء الفئران عن طريق التعرض 10 دقيقة إلى CO 2 بمعدل تدفق 1.3 لتر / دقيقة. ضمان موت الحيوان باتباع CO 2 التعرض مع خلع عنق الرحم قبل الشروع في تشريح.
- باستخدام تقنية نظيفة، تشريح خارج وفصل الظنبوب وأفخاذ؛ فخذان. تطهير الجلد الفأر مع الايثانول 70٪ قبل إجراء شق على طول السطح الأمامي من كل أطرافه الخلفية لكشف الساق وعظم الفخذ.
- قطع طريق مفصل الركبة لتحرير النهاية البعيدة لعظم الفخذ، وقطع طريق عظم الفخذ وعلى مقربة من الحوض ممكن. إزالة عظم الفخذ وتنظيف الكثير من الأنسجة اللينة وقت ممكن. لإزالة الساق، قطع طريق الكاحل وإزالة أكبر قدر ممكن من الأنسجة اللينة وقت ممكن.
- عقد العظام مع ملقط ونخاع دافق إلى 15 مل أنبوب مخروطي مع 2.5 مل درجة حرارة الغرفة α-MEM تجمع بين الإحمرار نخاع من ماوس واحدة في أنبوب واحد.
ملاحظة: سوف مطاردة نخاع ناجحة تغيير تلوين رانه العظام من اللون الأحمر إلى البيج. - السماح الحطام لتستقر في قاع الأنبوب ونقل طاف لتنظيف 15 مل أنبوب مخروطي مع أخذ الحيطة لتجنب نقل أي حطام.
ملاحظة: بعض الخلايا قد يستقر أيضا مع الحطام نخاع. إذا كنت بحاجة لعدد أكبر من الخلايا، الإحمرار نخاع يمكن أن تتم تصفيته من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر في أنبوب 15 مل نظيفة. - أنبوب الطرد المركزي (ق) في 300 x ج لمدة 5min في درجة حرارة الغرفة لتكوير الخلايا.
- فراغ نضح طاف و resuspend الخلية بيليه في 0.5 مل الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) الناشر العازلة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق لليز خلايا الدم الحمراء.
- إضافة 10 مل برنامج تلفزيوني مباشرة إلى ACK خلايا حل، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: يجب أن يكون بيليه الخلايا الحمراء سابقا الآن البيج. - فراغ طاف نضح وبيليه resuspend في 10 مل α-MEM، ولوحة في طبق المعالجة الثقافة 100 ملم الأنسجة. احتضان خلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية في ترطيبزراعة الأنسجة حاضنة.
ملاحظة: عد خلايا ليس من الضروري لهذه الخطوة. خلال هذا الوقت، سوف الخلايا الملتصقة من نخاع العظام نعلق على سطح الثقافة؛ ستبقى غير ملتصقة نخاع العظام السكان الخلية في تعليق. MCSF لم يكن موجودا في مستنبت خلال هذه الحضانة الأولية.
3. إثراء تآكل العظام Osteoclast السلائف
- بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها من الإحمرار النخاع، ونقل ثقافة طاف التي تحتوي على الخلايا غير ملتصقة إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
ملاحظة: أطباق الثقافة مع الخلايا الملتصقة، والتي تشمل العظام خلايا نخاع الوسيطة سلف، يمكن التخلص منها أو تغذية مع الطازجة α-MEM، إذا رغبت في ذلك لتجارب أخرى.
ملاحظة: الآكلة يمكن التفريق مباشرة من هذه الخلايا نخاع العظم غير ملتصقة من الطلاء لهم في أطباق المعالجة زراعة الأنسجة في كثافة 4 × 10 5 خلية / سم 2 في ناقضة العظم المتوسطة والمتوسطة منعش كل يوم لمدة 5 أيام. إضافة ألفا-MEM إلى حل الخلايا غير ملتصقة إلى الحجم النهائي من 18 مل وإضافة M-CSF إلى تركيز النهائي من 35 نانوغرام / مل. - إضافة 3 مل من تعليق خلية كل و 6 اطباق الثقافة تعليق 60 ملم.
- احتضان لوحات ليلا 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة ترطيب. خلال هذا الوقت، سوف تحفز M-CSF التفريق بين الضامة، والتي يمكن أن تنضم حتى على الأسطح المعالجة ثقافة غير الأنسجة.
- بعد تفرخ بين عشية وضحاها، وإعادة تغذية السلائف ناقضة العظم مع 3 مل المتوسطة بلعم جديدة. سيؤدي هذا إلى إزالة الخلايا غير ملتصقة التي لم يفرق في الضامة.
- تواصل السلائف ناقضة العظم الثقافة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 2 أيام أو حتى الثقافات تصل إلى ما يقرب من 70٪ التقاء.
4. تآكل العظام Osteoclast التمايز
- يغسل السلائف ناقضة العظم مع 5 مل برنامج تلفزيوني وعلاج الخلايا مع 1 مل المنشأ البحرية بروتين / انزيم حال للكولاجين في درجة حرارة الغرفة حتى سلليرة سورية يمكن إقصاؤه من خلال التنصت لطيف من لوحة.
ملاحظة: لا يمكن إلا ناقضة العظم السلائف أن يرفع إذا كانت مثقف في أطباق تعليق. السلائف نعلق بحزم أيضا على الأسطح المعالجة زراعة الأنسجة لرفعه. التربسين يمكن تنشيط السلائف ناقضة العظم ويجب تجنبها. - إضافة 4 مل α-MEM إلى كل طبق ونقل الخلايا إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وتمييع الخلايا إلى كثافة 5 × 10 4 خلية / مل وإضافة M-CSF إلى تركيز النهائي من 35 نانوغرام / مل وRANKL إلى تركيز النهائي من 100 نانوغرام / مل.
- خلايا البذور في مناطق ذات كثافة من 2.6 × 10 4 خلية / سم 2 في لوحات المعالجة زراعة الأنسجة واحتضان عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة ترطيب لمدة 2 أيام. ويتم التفريق عادة في 24 لوحات جيدا، حيث هي المصنفة 5 × 10 4 خلايا في كل بئر.
- 2 بعد أيام من بدء الخلايا والتمايز، وإعادة تغذية عن طريق استبدال المتوسطة مع 1 مل osteoc جديدةمتوسطة الماضي.
ملاحظة: سوف تآكل العظام Osteoclast التمايز وعادة ما تكون كاملة خلال 3 أيام. يمكن الآكلة الناتجة عن ذلك لتقدير سهل والتحليل الصرفي الملطخة الفخ.
5. تحفيز المستمر للاشارة الشق مع السطح المطلي Jagged1-
- تعليق الماعز مكافحة الإنسان مفتش التيسير الأجسام المضادة في برنامج تلفزيوني في تركيز 10 ميكروغرام / مل (1: 1000 تخفيف من 10 ملغ / مل الأسهم). إضافة حل الأجسام المضادة للسطح الثقافة في مناطق ذات كثافة من 1.3 ميكروغرام / سم 2 ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. في حالة 24 لوحات جيدة، إضافة 250 ميكرولتر (2.5 ميكروغرام) لكل بئر.
- فراغ الآبار نضح والملء مع 1 مل برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة 2 مرات.
- تعليق المؤتلف Jagged1-FC البروتين الانصهار في برنامج تلفزيوني في تركيز 10 ميكروغرام / مل. إضافة Jagged1-FC حل لسطح الثقافة المغلفة الأجسام المضادة في مناطق ذات كثافة من 1.3 ميكروغرام / سم 2 ويحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. السطوح الثقافة المغلفة مع الأجسام المضادة فقط. tذ يمكن استخدامها والضوابط.
- فراغ الآبار نضح والملء مع 1 مل برنامج تلفزيوني. كرر هذه الخطوة 2 مرات. حافظ على برنامج تلفزيوني في الآبار حتى قبيل الخلية البذر لمنعهم من الجفاف.
- البذور السلائف 2.6 × 10 4 ناقضة العظم / سم 2 على الأسطح المطلية. سيتم حفز درجة يشير بشكل مستمر لمدة 3 أيام على الأقل.
6. تحفيز المؤقت للاشارة الشق مع الخرز المغلفة Jagged1-
- الجمع بين ما يلي في أنبوب بحجم مناسب: 0.5 ميكروغرام / سم 2 Jagged1-FC، 21 ميكرولتر / سم 2 حبات بروتين G الاغاروز، وبرنامج تلفزيوني إلى الحجم النهائي من 1.5 مل. لإعداد عدد كاف من الخرز Jagged1 ل1 بئر من 24 لوحة جيدا، والجمع بين 1 ميكروغرام Jagged1-FC، 40 بروتين ميكرولتر G الخرز الاغاروز، وبرنامج تلفزيوني إلى 1.5 مل.
- احتضان أنبوب مع دوران في 4 ° مئوية لمدة 2 ساعة.
- أنبوب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 1 دقيقة لحبات بيليه. الخرز resuspend في 1.5 مل برنامج تلفزيوني. كرر هذا يغسل2 أكثر من مرة.
- Resuspend الخرز Jagged1 في 130 ميكرولتر / مستنبت سم 2 وتنطبق على الخلايا المستزرعة.
- احتضان الخلايا مع حبات عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 للفترة المطلوبة. إزالة الخرز مع عدة يغسل من برنامج تلفزيوني أو مستنبت.
- تحقق الشق يشير تفعيل عبر قياس الشق الهدف النصوص الجين 10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والهدف من هذه الطريقة هو أن الثقافة وتنشيط الشق يشير في السلائف ناقضة العظم. عندما مثقف بشكل صحيح، السلائف ناقضة العظم يحمل التشكل ممدود في المقام الأول على شكل مغزل مع السيتوبلازم السلس (الشكل 1A). يجب توخي الحذر لتجنب تنشيط المناعة من السلائف ناقضة العظم. على تفعيل والسلائف تنتشر وتصبح بالارض مع رغوي السيتوبلازم (الشكل 1B). هذه الخلايا "البيض المقلي" مقاومة للإشارات مراتب ولا تفرق بكفاءة في الخلايا الآكلة ناضجة. في ظل ظروف ثقافة والتمايز الصحيحة، والسلائف ناقضة العظم المخصب التفريق والصمامات في الخلايا الآكلة متعدد النوى كبيرة TRAP الإيجابي خلال ثلاثة أيام (الشكل 1C).
بذر السلائف ناقضة العظم على Jagged1-FC الأسطح المطلية يصل ينظم الجينات المستهدفة الشق خلال 24 ساعة(الشكل 2). جينات معينة تصل ينظم من قبل مما يشير الى الشق تختلف حسب نوع الخلية. في حالة السلائف ناقضة العظم، والجينات الأكثر السائد حتى ينظم من قبل Jagged1 هو Hes1، على الرغم من Hey2 وMyc على غير معتدل يصل التنظيم، كذلك. ولا يتم تغيير الجينات الشق المستهدفة الأخرى مثل Hey1 وP21 بشكل كبير عن طريق تحفيز Jagged1 السلائف ناقضة العظم.
عندما تكون السلائف ناقضة العظم مثقف في 24 لوحات جيدا، والمعاملة مع حبات المغلفة مع اقل من 600 نانوغرام Jagged1-FC يبرهن على وجود زيادة كبيرة في التعبير Hes1 خلال 24 ساعة (الشكل 3). وتبين ثمانية وأربعين ساعة العلاجات زيادة مماثلة في التعبير Hes1، وإن كان بدرجة أقل.
الشكل 1: الثقافة والتمايز السلائف ناقضة العظم. (A)السلائف ناقضة العظم ساذجة مثقف مع 35 نانوغرام / مل MCSF ودون مؤثرات تفعيل لديها على نحو سلس، التشكل على شكل مغزلي. شريط النطاق = 25 ميكرون. (ب) عند التنشيط المناعي والسلائف ناقضة العظم تتبنى بالارض، مورفولوجيا مليئة رغوة ولن تفرق في الخلايا الآكلة. للحث على تنشيط، تم علاج السلائف ناقضة العظم مع 10 نانوغرام / مل lipopolysaccharide في لمدة 16 ساعة. شريط النطاق = 25 ميكرون. (C) الساذجة مناعيا السلائف ناقضة العظم ملتصقة مثقف مع 35 نانوغرام / مل MCSF و 100 نانوغرام / مل لمدة 3 أيام تفرق في الخلايا الآكلة ناضجة. الآكلة ناضجة كبيرة، متعدد النوى، وفخ إيجابي. شريط مقياس = 200 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: ما يصل التنظيم من الجينات الشق الهدف في السلائف ناقضة العظم مطلي على يجمد Jagged1-FC. كانت مطلية السلائف ناقضة العظم على يجمد Jagged1-FC وتربيتها لمدة 24 ساعة. خلال الفترة الثقافة، وزيادة التعبير Hes1، Hey2، وMyc على مرنا. الجينات الشق الآخر المستهدف، Hey1 وP21 لم تتغير. أشرطة الخطأ والخطأ المعياري للمتوسط، أهمية وتقييمها باستخدام اختبار ر 1 الذيل الطالب. *، ف <0.05. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): ما يصل التنظيم من Hes1 مرنا في السلائف ناقضة العظم تعامل مع حبات Jagged1-FC. 600 نانوغرام خشنة-FC بد أن بروتين G حبات الاغاروز يصل ينظم التعبير Hes1 في السلائف ناقضة العظم مثقف في البئر من 24 لوحة جيداخلال 24 ساعة من التعرض. كان Hes1 تحريض من قبل Jagged1 الخرز مماثلة لمستويات Hes1 الناجم عن لوحات مغلفة Jagged1-FC. لم يتم تقييم الجينات الشق المستهدفة الأخرى التي لم يسببها بشدة لوحات مغلفة Jagged1-FC. أشرطة الخطأ والخطأ المعياري للمتوسط، أهمية وتقييمها باستخدام اختبار ر 1 الذيل الطالب. *، ف <0.05. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخطوات الحاسمة في البروتوكول
ثقافة والتمايز المختبر السلائف ناقضة العظم توفر منبرا مفيدا للتحقيق في الآليات الجزيئية من osteoclastogenesis وتحديد الأهداف العلاجية لتجديد العظام والحفاظ على كتلة العظام. عندما زراعة السلائف الماوس ناقضة العظم، العنصر الأكثر أهمية هو الحفاظ على السلائف في حالة ساذجة. كما الخلايا الشبيهة بلعم، وكانت سببا في السلائف ناقضة العظم للرد على المكونات البكتيرية والسيتوكينات الموالية للالتهابات. عند التنشيط، والسلائف ناقضة العظم تفرق لم يعد بكفاءة في الخلايا الآكلة. السبب الرئيسي لتفعيل السلائف وجود السيتوكينات الالتهابية مثل TNFα أو تكملة المعطل غير صحيح في المصل البقري الجنين. لهذا السبب، يجب أن يتم اختبار الكثير الأمصال لقدرتها على دعم osteoclastogenesis قبل استخدامها في التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، جميع الأمصال المستخدمة في osteocمشاركة الثقافة السلائف يجب الحرارة المعطل لتفسد تكملة التي يمكن تفعيل السلائف ناقضة العظم.
التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها
في هذه الطريقة، يتم استخدام Jagged1-FC لتحفيز الشق يشير في السلائف ناقضة العظم. الانصهار التيسير مع Jagged1 يسهل على حد سواء تجميد على السطوح الثقافة مع أضداد التيسير واقتران لبروتين G حبات. بروابط الشق أخرى تنصهر لجنة التيسير، مثل دلتا like1-FC، يمكن أن تستخدم بطريقة مماثلة. وتجدر الإشارة إلى أن ليس كل الموردين توفير البيانات المؤتلف النشاط الشق يجند. لذلك، في حين يمكن الحصول على بروابط الشق المؤتلف من موردين متعددين، يجب الحرص على الحصول على معلومات النشاط البيولوجية من المورد أو اختبارات بروابط في الخلايا يجند استجابة الشق المعروفة يجب أن يؤديها.
باستخدام البروتوكولات المذكورة في هذا الأسلوب يسمح لتحفيز التأسيسي ومؤقت للعلامة الشقأ لينج في السلائف ناقضة العظم مثقف. الطريقة المعيارية للكشف عن تفعيل الإشارات الشق هو القياس الكمي للجينات الشق الهدف عن طريق الكمي العكسية النسخ PCR (RT-QPCR). الجينات المستهدفة upregulated بواسطة إشارات الشق تختلف من خلية، وذلك عندما يتم تنفيذ تنشيط الشق على نوع من الخلايا uncharacterized سابقا، والتعبير لجنة من الجينات الشق الهدف الكنسي مثل أعضاء حس ويا ينبغي أن تحدد الأسرة من عوامل النسخ. في فترة زمنية أقصر، من المحتمل أن تفعيل الشق يتم الكشف عن طريق تقييم لطخة غربية من الشق بين الخلايا المجال حوال. ينبغي توخي الحذر، إذ أن هناك أربعة مستقبلات الشق وNICDs من مستقبلات مختلفة في أنواع مختلفة من الخلايا لم يتم الافراج بنفس الدرجة التالية التحفيز يجند. وينبغي أيضا أن تقارن مستوى حوال في الخلايا تحفز الشق إلى مستويات في الخلايا غير حفز لحساب الإفراج حوال الأساسي.
القيود المفروضة على تقنية في حين أن هذا الأسلوب هو المعمول به نظريا لجميع بروابط الشق، حتى الآن إلا أنها كانت باستمرار تطبيق باستخدام Jagged1 ودلتا like1 10، 20، 21. سوف تكون هناك حاجة مزيد من الاختبارات لتحديد ما إذا بروابط الشق إضافية قابلة إلى هذا الأسلوب. هذا الأسلوب هو أيضا غير محددة في تفعيل الشق مستقبله. تقييم محدد تفعيل الشق مستقبلات التحفيز التالية باستخدام هذا الأسلوب هو ضروري لصقه الاستجابات الخلوية إلى خاصة مستقبلات الشق.
أهمية هذه التقنية فيما يتعلق بأساليب الحالية / البديلة
ناقضة العظم التمايز يعتمد على كلا ناقضة العظم عدد السلائف وناقضة العظم السلائف التمايز المحتملة. تقييم التمايز ناقضة العظم من مختلطة بين السكان نخاع العظام لا يمكن التمييز بين التغيرات في PREC ناقضة العظمursor عدد وخلية مستقلة إمكانية التمايز. تخصيب السلائف ناقضة العظم السابقة لضوابط التمايز عن الاختلافات في الأرقام السلائف ويسمح الاستجواب أوثق لعملية التمايز ناقضة العظم. وبالنظر إلى أن الشق يشير تمارس تأثيرات مختلفة في نقاط مختلفة خلال osteoclastogenesis، والسيطرة الزمنية على حد سواء مما يشير الشق والتمايز ناقضة العظم ضرورية لتحقيق سليم في المسارات الجزيئية أنه يحكم.
التطبيقات المستقبلية بعد اتقان هذه التقنية
باستخدام هذا البروتوكول، وتقييم الأدوار للإشارة الشق لا يمكن أن يؤديها ليس فقط في السلائف ناقضة العظم، ولكن يحتمل أن تكون في أنواع الخلايا الأخرى، كذلك. بواسطة طول التحفيز الشق ووقت بدء الشق إشارات متفاوتة، ويمكن تعريف المحتملة أدوار متعددة طوري من الإشارات الشق في مجموعة متنوعة من عملية الخلوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Recombinant mouse M-CSF | Biolegend | 576402 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant mouse RANKL | Shenandoah Biotechnology | 200-04 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Recombinant human Jagged1-Fc | R&D Systems | 1277-JG-050 | Available from multiple suppliers, test activity before experiments |
| Protein G agarose beads | InvivoGen | gel-agg-2 | |
| Goat anti-human IgG Fc | Jackson ImmunoResearch | 109-001-008 | |
| Minimum Essential Medium powder | Sigma-Aldrich | M0894 | |
| Accutase cell dissociation reagent | ThermoFisher | A1110501 | Used to lift osteoclast precursors |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma-Aldrich | 387A-1KT | Used to stain differentiated osteoclasts |
References
- Harper, J. A., Yuan, J. S., Tan, J. B., Visan, I., Guidos, C. J. Notch signaling in development and disease. Clin Genet. 64 (6), 461-472 (2003).
- Andersson, E. R., Sandberg, R., Lendahl, U. Notch signaling: simplicity in design, versatility in function. Development. 138 (17), 3593-3612 (2011).
- Meloty-Kapella, L., Shergill, B., Kuon, J., Botvinick, E., Weinmaster, G. Notch ligand endocytosis generates mechanical pulling force dependent on dynamin, epsins, and actin. Dev Cell. 22 (6), 1299-1312 (2012).
- Chowdhury, F., et al. Defining Single Molecular Forces Required for Notch Activation Using Nano Yoyo. Nano Lett. 16 (6), 3892-3897 (2016).
- Chillakuri, C. R., Sheppard, D., Lea, S. M., Handford, P. A. Notch receptor-ligand binding and activation: insights from molecular studies. Semin Cell Dev Biol. 23 (4), 421-428 (2012).
- Vas, V., Szilagyi, L., Paloczi, K., Uher, F. Soluble Jagged-1 is able to inhibit the function of its multivalent form to induce hematopoietic stem cell self-renewal in a surrogate in vitro assay. J Leukoc Biol. 75 (4), 714-720 (2004).
- Small, D., et al. Soluble Jagged 1 represses the function of its transmembrane form to induce the formation of the Src-dependent chord-like phenotype. J Biol Chem. 276 (34), 32022-32030 (2001).
- Goncalves, R. M., Martins, M. C., Almeida-Porada, G., Barbosa, M. A. Induction of notch signaling by immobilization of jagged-1 on self-assembled monolayers. Biomaterials. 30 (36), 6879-6887 (2009).
- Varnum-Finney, B., et al. The Notch ligand, Jagged-1, influences the development of primitive hematopoietic precursor cells. Blood. 91 (11), 4084-4091 (1998).
- Zhu, F., Sweetwyne, M. T., Hankenson, K. D. PKCdelta is required for Jagged-1 induction of human mesenchymal stem cell osteogenic differentiation. Stem Cells. 31 (6), 1181-1192 (2013).
- Yang, B., et al. Effect of radiation on the Notch signaling pathway in osteoblasts. Int J Mol Med. 31 (3), 698-706 (2013).
- Urs, S., et al. Effect of soluble Jagged1-mediated inhibition of Notch signaling on proliferation and differentiation of an adipocyte progenitor cell model. Adipocyte. 1 (1), 46-57 (2012).
- LeComte, M. D., Shimada, I. S., Sherwin, C., Spees, J. L. Notch1-STAT3-ETBR signaling axis controls reactive astrocyte proliferation after brain injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (28), 8726-8731 (2015).
- Kostianovsky, A. M., Maier, L. M., Baecher-Allan, C., Anderson, A. C., Anderson, D. E. Up-regulation of gene related to anergy in lymphocytes is associated with Notch-mediated human T cell suppression. J Immunol. 178 (10), 6158-6163 (2007).
- Teitelbaum, S. L. Osteoclasts: what do they do and how do they do it? Am J Pathol. 170 (2), 427-435 (2007).
- Ma, J., et al. Disruption of the transcription factor RBP-J results in osteopenia attributable to attenuated osteoclast differentiation. Mol Biol Rep. 40 (3), 2097-2105 (2013).
- Bai, S., et al. NOTCH1 regulates osteoclastogenesis directly in osteoclast precursors and indirectly via osteoblast lineage cells. J Biol Chem. 283 (10), 6509-6518 (2008).
- Yamada, T., et al. Regulation of osteoclast development by Notch signaling directed to osteoclast precursors and through stromal cells. Blood. 101 (6), 2227-2234 (2003).
- Sethi, N., Dai, X., Winter, C. G., Kang, Y. Tumor-derived JAGGED1 promotes osteolytic bone metastasis of breast cancer by engaging notch signaling in bone cells. Cancer Cell. 19 (2), 192-205 (2011).
- Sekine, C., et al. Differential regulation of osteoclastogenesis by Notch2/Delta-like 1 and Notch1/Jagged1 axes. Arthritis Res Ther. 14 (2), R45 (2012).
- Ashley, J. W., Ahn, J., Hankenson, K. D. Notch Signaling Promotes Osteoclast Maturation and Resorptive Activity. J Cell Biochem. 116 (11), 2598-2609 (2015).
- Fukushima, H., et al. The association of Notch2 and NF-kappaB accelerates RANKL-induced osteoclastogenesis. Mol Cell Biol. 28 (20), 6402-6412 (2008).
- Canalis, E., Schilling, L., Yee, S. P., Lee, S. K., Zanotti, S. Hajdu Cheney Mouse Mutants Exhibit Osteopenia, Increased Osteoclastogenesis, and Bone Resorption. J Biol Chem. 291 (4), 1538-1551 (2016).
