Summary
التوسع في خلايا المريء للأطفال الإنسان الظهارية باستخدام برمجة مشروطة يوفر المحققين ويبلغ عدد سكانها المريض محددة من الخلايا التي يمكن استخدامها لهندسة البنى المريء لزرع ذاتي لعلاج العيوب أو الإصابات وتكون بمثابة خزان لفحوصات الكشف العلاجية.
Introduction
وقد هندسة الأنسجة المريء والمريء يوزيني (EOE) والتركيز على البحوث في العديد من المختبرات على مدى العقد الماضي. العيوب الخلقية، مثل رتق المريء، وينظر في ما يقرب من 1 في 4000 ولادة حية، مما يؤدي إلى تطوير ناقصة من المريء مما يؤدي إلى عدم القدرة على تناول الطعام 1. وكانت الإصابة وانتشار EOE في الارتفاع منذ التعرف على كيان المرض في عام 1993. وقوع EOE تختلف 0،7 حتي 10 / 100،000 فرد في السنة وتراوح انتشار ،2-43 / 100000 2. نهج الجراحية جذابة جديدة لعلاج الفجوة الطويلة رتق المريء يتمثل في توليد بنيات الأنسجة لزرع باستخدام خلايا المريض نفسه. وهذه الخلايا بالتزامن مع السقالات الاصطناعية توليد وبناء ذاتي التي لا تتطلب قمع المناعي. وقد بدأت بعض الجماعات بالفعل للتحقيق في الولايات المتحدة(ه) من خلايا شبيهة بخلايا المنشأ لهندسة الأنسجة المريء 3 فضلا عن استخدام الخلايا الظهارية المريء الأم إلى إعادة في الغشاء المخاطي 4-7. الأمراض التي تكون موجودة في المريء من الأطفال المرضى من الصعب تشخيص أو دراسة دون تدخل في كثير من الأحيان. وعلاوة على ذلك، النماذج الحيوانية الاستفادة أو في المختبر تخليد نماذج خط الخلية لأمراض الأطفال مثل EOE لا تشمل المرض والتسبب في الدقيق أو الاختلافات المحددة للمرضى 8. ولذلك، فإن القدرة على دراسة عملية مرض المريض في المختبر من أجل تحديد المرض مما اثار مستضدات معينة، وتقييم الآليات الكامنة وتحقيق العلاجات الدوائية ستكون رواية وتوفير الأطباء مع المعلومات التي يمكن أن تساعد في علاج المريض.
كانت هناك العديد من أنواع الخلايا ذاتي أو المريض محددة التي تم اقتراحها لاستخدامها في TISSUالهندسة الإلكترونية ودراسة المرضية الأمراض التي تصيب البشر. ومع ذلك، تقتصر بعض هذه أنواع الخلايا في قدرتها على توليد ما يكفي من الخلايا من النمط الظاهري محدد البذور سقالة كبيرة أو أداء إنتاجية عالية في الدراسات المختبرية. وقد تم استخدام الخلايا الجذعية المحفزة أو متعددة القدرات موضوع الكثير من النقاش الأبحاث، ولكن، والقيود وأوجه القصور لاستخدام هذه الخلايا قد وصفت بشكل جيد 9. استخدام الخلايا الجذعية الجنينية البشرية وناقش غاية وتقدم العديد من القضايا الأخلاقية. الأهم من ذلك، هذه الخلايا تشكل مسخي المبيض، والتي تتشابه إلى الورم، إذا لم تكن متباينة من دولة المحفزة فيها قبل تسليمها إلى الحية المضيفة 10. وعلاوة على ذلك، فإن استخدام الخلايا الجذعية الجنينية لا يكون المريض محددة، ويمكن أن يثير رد فعل الصنعية والحاجة إلى قمع المناعة 10. الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (iPSCs) هي الخلايا المحفزة التي يمكن أنأن تستمد من خلايا المريض نفسه. الخلايا الجسدية، مثل خلايا الجلد، ويمكن أن يتسبب في حالة المحفزة باستخدام مجموعة متنوعة من تقنيات متكاملة وغير متكاملة. هذه الخلايا بعد ذلك بمثابة مصادر خلية المريض محددة لهندسة الأنسجة أو التحقيق المرض. دمج المادة الوراثية غير المرغوب فيها في هذه الخلايا هو مصدر قلق كثير وقد وصفت وحتى لو المتتاليات هي تماما iPSCs إزالتها تظهر للحفاظ على "الذاكرة" جينية نحو نوع من الخلايا التي كانت مستمدة 11. هذه الخلايا أيضا ستشكل مسخي المبيض في الجسم الحي إن لم يكن يفرق قبل الزرع (11). وقد تم التحقيق في العديد من البروتوكولات التمايز التركيز على الأنساب الظهارية 12، 13، 14، ومع ذلك، فمن المهم جدا أن نلاحظ أن أنواع الخلايا مما يؤدي في نهاية التمايز ليست متجانسة و Oنلي امتلاك جزء من نوع من الخلايا في المصالح. وهذا يؤدي إلى انخفاض المحصول والحاجة إلى تنقية نوع من الخلايا المطلوبة. على الرغم من أن iPSCs هي مصدر الخلايا المحتمل المريض محددة، وعملية للحصول على نوع من الخلايا في المصالح إما هندسة الأنسجة أو التحقيق المرض غير فعال جدا.
وتم عزل الخلايا الظهارية البشرية بنجاح من مجموعة متنوعة من كل من الأنسجة المريضة وغير المريضة في الجسم البشري بما في ذلك: سرطان الرئة 15، وسرطان الثدي 16، الأمعاء الدقيقة 17 والقولون 18، المثانة 19 والمريء 20. من المهم أن نلاحظ أن الخلايا الأولية البشرية لديها عدد محدود من المقاطع التي يتم الحفاظ على النمط الظاهري 21، 22. للأسف، وهذا يعني أن عدد الخلايا اللازمة لتحقيق مرض أو لبذر سقالة هندسيالزرع قد لا يتحقق. لذلك، هناك حاجة إلى تقنيات جديدة لتوسيع خلايا المريض في حين لا يزال الحفاظ على النمط الظاهري الظهارية. وقد وصفت إعادة برمجة مشروطة من الخلايا الظهارية الطبيعية والسرطانية باستخدام الخلايا المغذية ومثبط ROCK في 2012 من قبل ليو وآخرون. 2 3. وقد استخدمت هذه التقنية لتوسيع الخلايا الظهارية السرطانية التي تم الحصول عليها من خزعات من البروستات وسرطان الثدي باستخدام الخلايا المغذية المشع، ROCK المانع والمتوسطة برمجة المشروط. وكان الهدف هو توليد ما يكفي من الخلايا لفحوصات في المختبر مثل فحص المخدرات. هذه التقنية قادرة على توسيع الخلايا الظهارية إلى أجل غير مسمى ب "إعادة برمجة" هذه الخلايا الجذعية أو حالة تشبه السلف، وهو التكاثري للغاية. وقد ثبت أن هذه الخلايا غير قابلة للمكون للأورام ولا تمتلك القدرة على تشكيل مسخي المبيض 23 و 24. وعلاوة على ذلك، لاكانت شذوذ الكروموسومات أو التلاعب الجيني الحالية بعد الركض هذه الخلايا في الثقافة باستخدام هذه التقنية 23، 24. الأهم من ذلك، هذه الخلايا قادرة على التمايز إلى نوع من الخلايا الأصلية من الفائدة فقط. لذلك، هذه التقنية توفر مخزون كبير من خلايا المريض محددة الظهارية للتحقيق مرض أو هندسة الأنسجة دون الحاجة لتخليد.
الحصول على الأنسجة الظهارية من جهاز معين لدراسة عمليات المرض غالبا ما يكون محدودا وليس من الممكن دائما بسبب خطر المريض. بالنسبة لأولئك المرضى الذين يعانون من أمراض المريء أو عيوب، بالمنظار استرجاع الخزعة هو نهج مينيملي للحصول على الأنسجة الظهارية التي يمكن فصلها وإعادة برمجتها مشروط لتوفير مصدر الخلية إلى أجل غير مسمى غير محددة في الغشاء المخاطي في المريء أن المريض. هذا ثم يسمح لفي الدراسات المختبريةمن الخلايا الظهارية لتقييم العمليات المرض والبحث عن العلاجات المحتملة. عملية مرض واحد التي يمكن أن تستفيد كثيرا من هذا النهج هو الإيزونوفيلي التهاب المريء، والتي وصفت بأنها أمراض الحساسية من المريء 8. اختبارات الحساسية وكذلك طرق علاجية يمكن تقييمها في المختبر باستخدام خلايا الظهارية الخاصة للمريض ويمكن بعد ذلك أن يتم تمرير هذه البيانات على الطبيب المعالج لوضع خطط العلاج الفردي. تقنية إعادة البرمجة الشرطية بالتعاون مع الحصول على الخزعات بالمنظار من الأطفال المرضى وتقدم القدرة على توسيع الخلايا الظهارية المريء العادية إلى أجل غير مسمى من أي مريض. ولذلك يمكن تعاونت هذا المصدر خلية جنبا إلى جنب مع السقالات الطبيعية أو الاصطناعية لتوفير خيار المريض محددة الجراحي للعيوب أو المرض أو الصدمة. أن وجود عدد الخلايا إلى أجل غير مسمى مساعدة مهندس يبني المريء التي تمتلك reseeded تماماالتجويف مع الخلايا الظهارية المريء من أجل المساعدة في تسهيل تجديد أنواع الخلايا المتبقية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وقد تم الحصول على عينات للفحص المريء بعد الحصول على الموافقة المسبقة من الآباء / أولياء الأمور من الأطفال المرضى وفقا للمجلس المراجعة المؤسسية (IRB # 13-094).
1. أدوات تعقيم والجيلاتين الحل
- ملقط الأوتوكلاف، شفرات الحلاقة ومقص قبل التعامل مع الأنسجة لمنع التلوث.
- لجعل 200 مل من 0.1٪ محلول الجيلاتين، والجمع بين 200 مل من الماء المقطر مع 0.2 غرام من الجيلاتين. الأوتوكلاف وبارد قبل استخدامها.
2. طلاء لوحات زراعة الأنسجة
- حوالي 2 ساعة قبل عزل الخلايا، إضافة ما يكفي من الجيلاتين 0.1٪ لتغطية صحن زراعة الأنسجة (100 ملم)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة الثقافة الخلية.
ملاحظة: يمكن أيضا أن تكون هذه اللوحات في وقت سابق ويوضع في حاضنة قبل الاستخدام.
3. صنع انزيم الحل لالتفكك
- ما يقرب من 30 دقيقة قبل عزل الخلايا، تزن خارج10 وحدات من dispase على التوازن على أساس وحدة في تركيز مليغرام في القارورة. وضع المسحوق في أنبوب مخروطي 15 مل مع 10 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) ووضعه في 37 ° C حمام الماء.
4. صنع خلية متوسطة الثقافة
- لجعل 50 مل من المتوسط برمجة المشروط، مزج المكونات التالية في أنبوب العقيمة المخروطية: 35 مل من F12 (هام والمتوسطة)، 11.5 مل من DMEM، و 0.5 مل من L-الجلوتامين، 0.5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين، 2.5 مل من مصل بقري جنيني (FBS)، 250 ميكروغرام من الأنسولين البشري، 500 نانوغرام من عامل نمو البشرة البشري (EGF).
- لجعل 500 مل من 3T3 المتوسطة، خلط 50 مل من FBS و 5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين و 5 مل من L-الجلوتامين مع 500 مل من DMEM.
- لجعل 500 مل من الخلايا الكيراتينية المصل خالية المتوسطة، ذوبان الجليد EGF والأبقار النخامية استخراج (BPE) المكملات الغذائية (المتوفرة مع وسائل الإعلام). إضافة ملاحق مل زجاجة 500 متوسطة أساسية وإضافة 5 مل من 100X البنسلين / الستربتومايسين
5. التثقيف واضاءة 3T3 الخلايا كمصدر تغذية
- إعداد 3T3 المتوسطة، التي تضم DMEM، و 10٪ FBS، 1X البنسلين / الستربتومايسين و2 مم L-الجلوتامين.
- ثقافة 3T3 الخلايا في الأنسجة المعالجة T-75 قوارير قبل 3 أيام على الأقل من وصول عينات المرضى.
- قبيل وصول عينات المرضى، ويعرض للتريبسين 3T3 الخلايا باستخدام 5 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA في القارورة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق أو حتى معظم الخلايا تطفو
- إضافة 5 مل من 3T3 المتوسطة لوقف التفاعل. نضح تعليق الخلية ونقل إلى أنبوب مخروطي 15 مل. تدور لمدة 5 دقائق في 300 × ز.
- نضح المتوسطة و resuspend الخلايا في حجم محدد من التريبان الأزرق لعد الخلايا. الجمع بين 10 ميكرولتر من الخلايا مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق لاستبعاد الخلايا الميتة. تحميل 10 ميكرولتر من هذا الحل على عدادة الكريات لحساب الخلية.
ملاحظة: للحصول على هذا بروتوالعقيد، كثافة البذر ل3T3 الخلايا المشع هو 10،900 الخلايا لكل سم 2، أي ما يعادل 600000 خلايا لكل لوحة 100 ملم. - قسامة عدد الخلايا اللازمة لوحة لوحة 100 ملم في عينة المريض وresuspend في 25 مل من 3T3 المتوسط في أنبوب مخروطي 50 مل وأشرق مع 3000 راد.
- بعد التشعيع، وخلايا تدور باستمرار لمدة 5 دقائق في 300 x ج و resuspend في المتوسط برمجة مشروط في 5 مل لكل لوحة 100 ملم.
- تعيين أنبوب جانبا حتى يأخذ الطلاء من خلايا المريض في وقت لاحق في البروتوكول (راجع الخطوة 7.6).
6. الحصول على وحفظ ونقل الأطفال المريء الخزعات
- إضافة 5 مل من المصل خالية المتوسطة القرنية كاملة مع 100 ميكروغرام / مل primocin لأنابيب مخروطية 15 مل وإحضاره إلى منشأة طبية على الجليد.
ملاحظة: هذه الأنابيب المتوسطة يمكن تخزينها في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 2 أشهر. - الحصول على ما يقرب من 8 الخزعات المريء في منظمة الشفافية الدوليةلي من التنظير ومستقل على النحو التالي:
- وضع ستة الخزعات في مل المخروطية 15 تحتوي على كامل القرنية المتوسطة مجانا المصل مع 100 ميكروغرام / مل primocin ومكان على الجليد الرطب.
- وضع خزعة واحدة في 5 مل من الفورمالين مخزنة ومكان على الجليد الرطب.
- وضع خزعة واحدة في خزعة صغيرة cryomold مع الأمثل مجمع درجة حرارة القطع.
- على الفور إسقاط هذا القالب في كوب من نظير البنتان وضعها في النيتروجين السائل. مرة واحدة المجمدة، ضع cryomold في كيس العينة وتخزينها على الثلج الجاف في وعاء رغوة البوليسترين.
- وضع أنابيب تحتوي على الخزعات في المتوسطة أو الفورمالين داخل كيس قابل للغلق وبعد ذلك في علبة الشحن التي تحتوي على الجليد الرطب. ختم وتسمية مربع مع التسمية واقية ونقلها إلى المختبر.
ملاحظة: الحاوية التي تحتوي على الثلج الجاف والخزعة المجمدة مختومة أيضا وصفت مع تسمية اقية.
7. معالجةالأنسجة للمريض للثقافة وتحليل المصب
- لدى وصوله الى المختبر، ونقل خزعة المجمدة على الثلج الجاف إلى -80 درجة مئوية الفريزر لباجتزاء المصب أو استخراج الحمض النووي الريبي. وضع العينة في الفورمالين. تخزين في 4 درجات مئوية الثلاجة والسماح لإصلاح بين عشية وضحاها.
- تدور الخزعات المتبقية إلى أسفل في 300 x ج، ونضح المتوسطة. إضافة 10 مل من dispase حل للأنبوب مخروطي الشكل، وختم والسماح لها لاحتضان عند 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 15 دقيقة.
- بعد الحضانة، وتدور الخزعات إلى أسفل في 300 × ز. نضح الخزعات المتوسطة و resuspend في 5 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA.
- نقل 5 مل من التربسين-EDTA تحتوي على خزعات لوحة معقمة 100 ملم واللحم المفروم الخزعات باستخدام 2 شفرات الحلاقة معقمة كما غرامة ممكن.
- نقل 5 مل من التربسين-EDTA تحتوي على الخزعات المفروم إلى جديد 15 مل المخروطية. شطف لوحة مرتين مع 5 مل إضافية من 0.05٪ التربسين-EDTA وإضافة إلى المخروطيةالة النفخ. احتضان الأنبوب لمدة 10 دقيقة في 37 ° C حمام الماء.
- بعد الحضانة، وتدور الخزعات إلى أسفل في 300 x ج (1.4 دورة في الدقيقة) لمدة 5 دقائق، ونضح المتوسط. إضافة 5 مل من المتوسط برمجة مشروط لأنبوب مخروطي الشكل وكذلك 5 مل من المتوسط برمجة المشروط الذي يحتوي على الخلايا المغذية المشع (راجع الخطوة 5.7).
- إضافة ROCK المانع (1 ميكرولتر / مل) إلى 10 مل من تعليق خلية ولوحة بعد الشفط الجيلاتين من صحن زراعة الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية.
8. التثقيف وخلايا التوسع
- بعد حوالي 5 أيام من الثقافة، نضح في والمتوسطة الأولي التي تحتوي على قطع مفروم-الخزعة وشطف طبق 2-3 مرات مع 5 مل برنامج تلفزيوني العقيمة. إضافة سيلة جديدة لوحة بما في ذلك المانع ROCK في 10 ميكرومتر.
- عند الوصول إلى 70٪ confluency، توسيع الخلايا. إضافة 5 مل من 0.05٪ التربسين-EDTA لوحة واحتضان في حاضنة 37 درجة مئوية أي أكثر من 2.5 دقيقة لإزالة الالخلايا المغذية ه. وبعد أن الحضانة، ونضح التربسين-EDTA وشطف لوحة مع 5 مل من برنامج تلفزيوني.
- نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 5 مل من 0.25٪ التربسين-EDTA لوحة واحتضان لمدة 5-10 دقائق أو حتى الخلايا هي فضفاضة من لوحة. إضافة كميات متساوية من متوسطة إلى لوحة لوقف التفاعل ونقل جميع السوائل إلى أنبوب 50 مل المخروطية وتدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- Resuspend الخلايا في حجم محدد من المتوسطة برمجة المشروط ومزيج 10 ميكرولتر من تعليق مع 10 ميكرولتر من التريبان الأزرق. الاعتماد على عدادة الكريات لتحديد إجمالي عدد الخلايا.
- لتوسيع الخلايا، إضافة 1 مليون خلية المريء الإنسان إلى لوحة 150 ملم مع 1.2 مليون المشع 3T3 الخلايا في الحجم الكلي لل15 مل. إضافة ROCK المانع جديدة على 10μM وإضافة تعليق الخلية على طبق الجيلاتين المغلفة 150 ملم.
9. خلايا تجميد وتخزين الإنسان المريء طلائي
- لجعل تجميد المتوسطة، إضافة 10٪DMSO إلى متوسطة برمجة المشروط. بعد trypsinizing والعد، قسامة الخلايا لتجميد في أنبوب 50 مل المخروطية جديد وتدور باستمرار في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
- نضح المتوسطة وإضافة تجميد المتوسطة في حجم 2 مل لكل cryovial. مرة واحدة تعليق خلية متجانسة، قسامة 10 6 خلايا في cyrovials المسمى مسبقا. مكان في وعاء التجميد في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل قبل تحريك قارورة لتخزين الطويل الأجل النيتروجين السائل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
وتتلخص ملخص من الخطوات الرئيسية في عزل الخلايا الظهارية المريء من الخزعات المريض في الشكل 1. سوف مستعمرات الخلايا الظهارية تشكل في حوالي 4-5 أيام، وسوف تكون محاطة الخلايا الليفية التغذية (الشكل 2A). ومع توسع هذه المستعمرات أنها سوف تندمج مع غيرها من المستعمرات لتشكيل المستعمرات الكبيرة (الشكل 2B). مرة واحدة أصبحت الثقافات 70٪ متموجة، فإنها تحتاج إلى توسيعها (الشكل 2C). لضمان أن تتم إزالة الخلايا الليفية من لوحة قبل إزالة الخلايا الظهارية، ويستخدم 0.05٪ التربسين-EDTA لمدة تصل إلى 2.5 دقيقة لإزالة مغذيات. غياب مغذيات يجب أن يتشابه الشكل 2D. ثم يتم trypsinized الخلايا الظهارية الملتصقة مع 0.25٪ التربسين-EDTA وreplated على الخلايا المغذية المشع جديدة (الشكل 2E).
رقيقة الصفحات = "1"> توصيف المظهري من هذه الخلايا عبر QRT-PCR يوضح upregulation من P63، وهو علامة من الخلايا الاصلية في نهاية الممر 1، في حين لا يزال الحفاظ على كادهيرين E والتعبير TJP1 بالمقارنة مع عينة خزعة الأولية . وهذا يدل على أن الخلايا قد تم "إعادة برمجة" لمزيد من السلف / شبيهة بخلايا المنشأ الدولة التي هي أكثر التكاثري مقارنة مع الخلايا غير برمجتها. عندما تؤخذ هذه الخلايا من شروط إعادة برمجة المشروطة ومطلية على لوحات زراعة الأنسجة العادية، والتعبير عن انخفاض P63 وTJP1 وE-كادهيرين (CDH1) يزيد يدل على تحول في النمط الظاهري من خلية سلفية إلى الخلايا الظهارية أكثر متباينة (الشكل 3A ). وقد تم تحليل هذه الخلايا أيضا في مرور 1 للعلامات الظهارية عبر التدفق الخلوي وأكبر من 90٪ من الخلايا الحالية من ثلاثة مرضى كان إيجابيا للEpCAM (الشكل 3B). وقد تم تحليل الخلايا أيضا عن طريق المناعي في المقاطع 1 و 3 لضمان النمط الظاهري على تلك الممرات 3 لم يتغير. يوضح تلطيخ استمرار الظهارية علامة E-كادهيرين (الشكل 4A-D)، السلف علامة P63 (الشكل 4E-H)، وانتشار علامة KI-67 (الشكل 4I-L) والظهارية TJP1 ضيق البروتين تقاطع (الشكل 4M-P ).
وأخيرا، تم رسم منحنى النمو باستخدام خط خلية من المريض غير المصاب لتقييم الوقت مضاعفة هذه الخلايا في ثقافة إعادة برمجة المشروطة. كانت مطلية الخلايا في 100،000 الخلايا في اليوم 0 ووجد أن قليلا فقط أكثر من 500،000 الخلايا في يوم 4 (الشكل 5). تم احتساب مضاعفة الوقت إلى أن ما يقرب من 36-40 ساعة. ومن المتوقع أن الخلايا المريضة وسوف يكون الوقت مضاعفة أبطأ، ومع ذلك، ينبغي تقييم كل مريض على حدة لمراعاة الفروق الفردية.
1 ">
الشكل 1: نظرة عامة على عزل وخلايا التثقيف الإنسان المريء طلائي من الأطفال الخزعات. ويتم الحصول على عينات من الأطفال المرضى بعد الموافقة المسبقة ونقلها في المصل خالية المتوسطة الكيراتينية إلى المختبر. ثم يتم التعامل مع هذه الخزعات مع 1 يو / مل من dispase، تليها تنميق النسيج مع شفرات الحلاقة معقمة وعلاج أخيرا مع 0.05٪ التربسين-EDTA. ثم يتم إضافة تعليق الخلية إلى الخلايا المغذية المشع في المتوسط برمجة المشروط. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: زراعة والتوسع في خلايا الإنسان المريء طلائي. بعد 5 أيام في إعادة برمجة مشروطةمينغ المتوسطة، تبدأ الخلايا الظهارية المريء لتشكيل مستعمرات صغيرة الحصوه (A)، والتي تلتقي في نهاية المطاف إلى تشكيل المستعمرات الكبيرة (B). بمجرد أن يصل طبق نسيج الثقافة 70٪ التقاء (C)، يتم التعامل مع لوحات لفترة وجيزة للغاية مع 0.05٪ التربسين-EDTA لإزالة الخلايا المغذية، في حين لا يزال الحفاظ على التزام من الخلايا الظهارية (D). ثم تتم إزالة الخلايا الظهارية مع 0.25٪ التربسين-EDTA وreplated مع الخلايا المغذية جديدة. فقط 24 ساعة بعد تقسيم هذه الخلايا أنها سوف تشكل مستعمرات جديدة والاستمرار في تتكاثر (E). التكبير 100X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: التدفق الخلوي وQRT فتحليل CR من خلايا الموسع في الثقافة. (أ) التعبير الجيني الممثل من الخلايا في الثقافة في الممر 1 من إعادة برمجة مشروطة أظهرت زيادة بنسبة 6 أضعاف في التعبير P63، وهو علامة من الخلايا الاولية وكذلك انخفاض في علامات الظهارية CDH1 وTJP1 بالمقارنة مع التعبير خزعة الجينات. وهذا يدل على السكان الخلية في حالة المزيد من مثل السلف وأكثر التكاثري للغاية ول. التعبير الجيني 24 ساعة بعد إعادة برمجة (بعد إزالة الخلايا المغذية وROCK المانع) يدل على زيادة CDH1 وTJP1 التعبير ولكن انخفاض في التعبير P63. (ب) تحليل التدفق الخلوي للخلايا من المرضى متعددة الحصول على مرور 1 إظهار أكبر من 90٪ من الخلايا معربا عن EpCam. المريض 27 يمثل خلايا المريض غير EOE، في حين أن المرضى 26 و 28 خلايا المريض EOE. الرجاء الضغط هنا رس عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: المناعي تلون الخلايا في المقاطع 1 و 3. خلايا نمت في المتوسط برمجة مشروط مع الخلايا المغذية المشع صريح E-كادهيرين (A - D) وكذلك P63 السلف علامة (E - H). هذه الخلايا لا تزال التكاثري في مرور 3 (I - L). وأخيرا، وهذه الخلايا تعبر عن البروتين تقاطع ضيق 1 (TJP1)، الذي هو أيضا بما يتفق مع النمط الظاهري الظهارية (M - P). وcounterstained نوى مع دابي (الأزرق) ويتم الكشف عن الأجسام المضادة باستخدام اليكسا فلور 546 الضد (البرتقال). وتمثل 2 الثانية الأجسام المضادة (أب) مراقبة غير محددة ملزمة من الأجسام المضادة الثانوية للأنسجة (س، ص). الحانات النطاق = 50ميكرون. التكبير 200X. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 5: منحنى نمو الخلايا في إعادة برمجة المشروطة. وكانت المصنفة الخلايا في المتوسط برمجة مشروط من المريض غير المصاب في مناطق ذات كثافة محددة ونسخ متماثلة من احصي ثلاثة كل يوم لمدة 4 أيام. تم إنشاء منحنى النمو باستخدام هذه التهم الخلية ومضاعفة الوقت الذي تم احتسابها بناء على الأرقام التي تم الحصول عليها في يوم 4 و يوم 0. الساعة مضاعفة هذه الخلايا هو حوالي 36-40 ساعة. أشرطة الخطأ تشير إلى الخطأ المعياري. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أهم الخطوات من أجل عزل وتوسيع الخلايا الظهارية المريء من الخزعات المريض هي: 1) عدم الربط على نحو كاف الأنسجة الخزعة مع الحد الأدنى من موت الخلايا. يضاف 2) ضمان المانع ROCK إلى مستنبت الخلية في كل تغيير المتوسط؛ 3) لا تستخدم أكثر من الخلايا المغذية من الموصى بها. 4) الحفاظ على ثقافة العقيم النظيفة؛ و5) خلايا مرور فقط قبل الوصول إلى نقطة التقاء.
نظرا للاختلافات ذات الصلة المريض في عينات الخزعة الحصول عليها من أجل إعادة برمجة المشروطة، فمن المعقول أن نتوقع الاختلافات في حركية النمو، والنمط الظاهري والقدرة على التوسع إلى مقاطع متعددة. عادة، يتم الحصول على 4 الخزعات المريء من كل مريض لعزل الخلايا. مرة واحدة فصل، ونحن صافي حوالي 300،000-600،000 الخلايا في اليوم 0. هذا يتسع لأكثر من 10 مليون الخلايا عن طريق مرور 3 في المتوسط. مورفولوجية المستعمرات التي تشكل ينبغي أن تبدو مشابهة إلى التشكل الحصوه وصفها لخطوط الخلايا الظهارية <سوب الطبقة = "XREF"> 25 (الشكل 2). وينبغي تحليل عينة من الخلايا في الثقافة عبر QRT-PCR، التدفق الخلوي والمناعي للعلامات الظهارية لضمان زيادة عدد السكان زيادة هي في الواقع الظهارية في الأصل (الشكل 3). هذه الخلايا يجب أن تعبر عن علامات الظهارية (E-كادهيرين، EpCAM، TJP1)، لا بد من إنهاء خط الخلايا والتخلص منها. ومن المتوقع أن أكثر من 90٪ من الخلايا الحالية هي EpCAM إيجابي إذا كانت الظهارية في الأصل. من أجل تقييم ما إذا كان الثقافات تتغير النمط الظاهري أو يفقد الظهارية التعبير، المناعي أو التدفق الخلوي ينبغي أن تستخدم لتقييم علامات الظهارية (E-كادهيرين)، السلف التعبير (P63)، والظهارية البروتينات مفرق ضيق (TJP1). كما و passaged الخلايا ومن المتوقع أن النمط الظاهري لا ينبغي أن يتغير، يجب أن انتشار ولا تنقص وهذه الخلايا يجب أن يعرض التعبير الظهارية وكذلك التعبير السلف (الشكل 4 (الشكل 5). هي الخلايا التي تم العثور عليها لا أن يتضاعف لأكثر من 5 أيام المرجح أن تكون هرمة، وينبغي التخلص منها.
وقد وصفت ذلك أن الخلايا المعزولة من المرضى الذين يعانون من العمليات الالتهابية الحالية، مثل EOE، تمتلك الخلايا الظهارية التي لديها معدل التكاثري انخفضت، وانخفضت التعبير E-كادهيرين (الشكل 3، المرضى 26 و 28) ونسبة عالية من موت الخلايا المبرمج 26. وبالتالي، فإنه ليس من غير المعقول أن يكون خلايا صعوبة زراعة من مريض مريضا بشدة باستخدام هذا الأسلوب. ومن الممكن أن الخلايا سوف تصمد سوى بضع فقرات أو حتى مرور فقط الأولي. وهذا ينبغي أن لا تزال توفر المحقق مع عدد أكبر من الخلايا من عزلة أصلا. ومع ذلك، قد لا يكون هذا عدد كافلجميع الدراسات المقترحة. منذ تستخدم هذه الخلايا لدراسة في النهاية مرض المريء أو بناء بديل المريء، من المهم أن نتذكر هذه الخلايا هي المسؤولة فقط لتجديد الغشاء المخاطي. أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا الليفية، الخلايا العصبية، وخلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية هي أيضا نفس القدر من الأهمية لدراسة أمراض المريء ولتطبيقات هندسة الأنسجة.
تقدم هذه التقنية مصدر خلية المريض محددة التي هي أداة لا تقدر بثمن لدراسة المرضية المرض، وكذلك بمثابة خزان محتمل من خلايا المريض محددة لتطبيقات هندسة الأنسجة المريء. خلايا استخدمت لبذر الحيوية لزرع الجراحية يجب أن تكون خالية من العيوب الوراثية، وتسلسل الفيروسية ولا تشكل مسخي المبيض. استخدام الخلايا الجذعية (متعدد القدرات أو المحفزة) يولد الكثير من أنواع الخلايا غير المرغوب فيها التالية التمايز، وبعضها يمكن أن تشكل مسخي المبيض اذا لم تخضع مختلفاtiation. وعلاوة على ذلك، فإن هذا النمط الظاهري مصدر خلية ثابت ولا يتطلب تنقية أو إزالة الخلايا غير المرغوب فيها. فإن مصدر خلية المثالي سيكون الخلايا التي تم العثور عليها في موقع تشريحي نفسه الذي يتم هندستها. في هذا النهج ويجري استخدام هذه الخلايا الظهارية المريء إلى إعادة في الغشاء المخاطي للسقالة المريء. وهناك حاجة إلى أنواع الخلايا إضافية لتجديد المريء. ومع ذلك، كان محور هذه التقنية لضمان وreseeded الغشاء المخاطي وليس ناقصة لأن ذلك يمكن أن يؤدي إلى تسرب، تضيق وتثقيب.
بالإضافة إلى الاستفادة من هذه الخلايا لهندسة خيارات جراحية جديدة لالمريء، ويمكن أيضا هذه الخلايا يمكن استخدامها لدراسة عمليات المرض المريء وكذلك الشاشة لأساليب علاجية جديدة لعلاج هذه الظروف. يوصف التهاب المريء اليوزيني (EOE) ومرض حساسية من المريء، مع أن الآلية الدقيقة والمرضية وصفت لم بالكامل. ريج العلاج الحاليوتشمل iments الوجبات القضاء، المنشطات عن طريق الفم والتنظير متعددة. لا يوجد فحص لتقييم ما يتسبب في العملية الالتهابية لكل مريض، الأمر الذي يؤدي الأطباء لاستخدام "تخمين وتحقق" النهج الذي طويلة وغالبا محبطة للمريض. منذ هذا الأسلوب من التوسع خلية المريض محددة لا تستخدم تنبيغ lentiviral أو التعديل الوراثي، وإمكانية تغييرات دائمة في التركيب الوراثي للخلايا من عملية إعادة البرمجة هو الحد الأدنى. وهذا يعني تبقى الخلايا نظريا دون تغيير عن البيئة في الجسم الحي. القدرة على اختبار خلايا المريض في المختبر لتحديد ان وكيل اثار يكون رواية، ويمكن أن تؤدي في نهاية المطاف إلى تطوير التشخيص أو علاجات جديدة لهؤلاء المرضى الأطفال.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
