Summary
Utbyggnad av mänskliga pediatriska esofagus epitelceller som utnyttjar villkorad omprogrammering ger utredarna med en patient specifik population av celler som kan användas för att konstruera matstrupen konstruktioner för autolog implantation för behandling av defekter eller skada och fungerar som en reservoar för terapeutiska screeningsanalyser.
Introduction
Matstrupen vävnadsteknik och eosinofil esofagit (EoE) har varit i fokus för forskning i många laboratorier under det senaste decenniet. Medfödda defekter, såsom esofagusatresi, ses i cirka 1 i 4000 levande födda, vilket resulterar i ofullständig utveckling i matstrupen som leder till oförmåga att äta en. Incidensen och prevalensen av EoE har varit på uppgång sedan identifiering av sjukdomsbegrepp 1993. Förekomsten av EoE varierade från 0,7 till 10 / 100.000 per årsverke och prevalensen varierade från 0,2 till 43 / 100.000 2. En ny attraktiv kirurgisk metod för behandling av långa gap esofagusatresi består i att generera vävnadskonstrukten för implantering med användning av patientens egna celler. Dessa celler i kombination med syntetiska byggnadsställningar kommer att generera en autolog konstruktion som inte kräver immunsuppression. Vissa grupper har redan börjat undersöka osse stamliknande celler för esofageal tissue engineering 3 såväl som användningen av nativa esofagus epitelceller för att återbefolka slemhinnan 4-7. Sjukdomar som finns i matstrupen av pediatriska patienter är ofta svåra att diagnostisera eller studera utan ingripande. Dessutom använder djurmodeller eller in vitro odödlig cellinje modeller för barnsjukdomar som EoE omfattar inte den exakta sjukdomen patogenes eller patientspecifika skillnader 8. Därför är förmågan att studera en patients sjukdomsprocessen in vitro i syfte att identifiera specifika sjukdoms utlösande antigener, utvärdera underliggande mekanismerna och undersöka läkemedelsbehandlingar skulle vara nytt och ge kliniker med information som kan underlätta patientbehandling.
Det har funnits många autologa eller patientspecifika celltyper som har föreslagits för användning i tissue teknik och studera mänskliga sjukdomar patogenes. Emellertid vissa av dessa celltyper är begränsade i sin förmåga att alstra tillräckligt med celler av en viss fenotyp för att ympa en stor byggnadsställning eller utföra hög genomströmning in vitro-studier. Användningen av pluripotenta eller multipotenta stamceller har varit föremål för mycket forskning diskussion, dock begränsningar och tillkortakommanden för att använda dessa celler har beskrivits väl 9. Användningen av mänskliga embryonala stamceller är mycket diskuteras och presenterar många etiska frågor. Viktigast dessa celler bildar teratom, som liknar en tumör, om de inte skiljer sig från deras pluripotent tillstånd före att leverera dem till en levande värd 10. Dessutom skulle användningen av embryonala stamceller inte vara patientspecifika och kan framkalla en allogen svar och behovet av immunsuppression 10. Inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) är pluripotenta celler som kanhärledas från en patients egna celler. Somatiska celler, såsom hudceller, kan induceras att ett pluripotent tillstånd genom att använda en variation av integrativa och icke-integrativa tekniker. Dessa celler fungerar sedan som en patientspecifika cellkällor för vävnadsteknik eller sjukdomsundersökning. Integrationen av oönskat genetiskt material in i dessa celler är ett bekymmer många har beskrivits och även om sekvenserna är fullständigt avlägsnade iPSCs tycks bevara en epigenetisk "minne" i riktning mot den celltyp från vilken de var härledda 11. Dessa celler kommer också att bilda teratom in vivo om inte differentierade före transplantation 11. Många differentieringsprotokoll har undersökts med fokus på epiteliala härstamningar 12, 13, 14, är det dock mycket viktigt att notera att de celltyper som resulterar i slutet av differentiering inte är homogena och only besitter en bråkdel av celltypen av intresse. Detta resulterar i lågt utbyte och behovet av att rena den önskade celltypen. Även iPSCs är en potentiell patientspecifik cellkälla, till processen få en celltyp av intresse för antingen tissue engineering eller sjukdomsundersökning är mycket ineffektivt.
Humana epitelceller har framgångsrikt isolerats från en mängd av både sjuka och icke-sjuk vävnad i människokroppen inklusive: lunga 15, bröst 16, tunntarm 17, kolon 18, urinblåsa 19 och matstrupen 20. Det är viktigt att notera att humana primära celler har ett ändligt antal passager i vilka fenotypen upprätthålls 21, 22. Tyvärr innebär detta att antalet celler som behövs för sjukdomsundersökning eller sådd en konstruerad byggnadsställningför implantation inte kan uppnås. Därför är nya tekniker som behövs för att expandera patientceller och samtidigt bibehålla en epitelial fenotyp. Villkorlig omprogrammering av normala och cancer epitelceller utnyttjar matarceller och ROCK-inhibitor beskrevs 2012 av Liu et al. 2 3. Denna teknik användes för att expandera cancerous epitelceller erhållna från biopsier av prostata- och bröstcancer med användning av bestrålade matarceller, ROCK-inhibitor och villkorlig omprogrammering medel. Målet var att skapa tillräckligt med celler för in vitro-analyser såsom läkemedelsscreening. Denna teknik är i stånd att expandera epitelceller obestämd tid genom "omprogrammering" dessa celler till en stam eller stamfader-liknande tillstånd, som är mycket proliferativ. Det har visats att dessa celler är icke-tumörframkallande och inte har förmågan att bilda teratom 23, 24. Dessutom ingenkromosomavvikelser eller genetiska manipulationer var närvarande efter passage dessa celler i odling med hjälp av denna teknik 23, 24. Viktigast av allt, dessa celler kan bara att differentieras till den nativa celltypen av intresse. Därför erbjuder denna teknik en stor reservoar av patientspecifika epitelceller för sjukdomsundersökning eller vävnadsteknik utan behov av odödliggörande.
Erhålla epitelvävnad från ett visst organ för att studera sjukdomsprocesser är ofta begränsad och inte alltid möjligt på grund av patientens risk. För de patienter som lider av matstrupen sjukdom eller brister, är endoskopisk biopsi hämtning en minimalinvasiv metod för att erhålla epitelvävnad som kan skiljas och villkorligt omprogrammeras för att ge en obestämd cellkälla som är specifik för slemhinnan i det patientens matstrupe. Detta möjliggör sedan för in vitro-studierav epitelcellerna att utvärdera sjukdomsprocesser och skärm för potentiella läkemedel. En sjukdomsprocess som i hög grad skulle kunna dra nytta av denna metod är Eosinophilic Esofagit, som har beskrivits som allergisk sjukdom i matstrupen 8. Allergitester samt terapeutiska metoder kan utvärderas in vitro med hjälp av patientens egna epitelceller och dessa data kan sedan föras till den behandlande läkaren att utveckla individuella behandlingsplaner. Tekniken av villkorad omprogrammering i samband med att erhålla endoskopiska biopsier från pediatriska patienter ger möjlighet att expandera normala esofagus epitelceller på obestämd tid från någon patient. Denna cellkälla kan därför slagit ihop med naturliga eller syntetiska byggnadsställningar att tillhandahålla en patientspecifik kirurgiskt alternativ för defekter, sjukdom eller trauma. Med en obestämd celltal skulle bidra till ingenjör esofagus konstruktioner som besitter en helt reseededlumen med esofageala epitelceller för att hjälpa till att underlätta regenerering av de återstående celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Esofagus biopsier erhölls efter informerat samtycke erhölls från föräldrar / vårdnadshavare för pediatriska patienter och i enlighet med Institutional Review Board (IRB # 13-094).
1. sterilisering av instrument och gelatinlösning
- Autoklav pincett, rakblad och saxar före hantering vävnad för att förhindra förorening.
- För att göra 200 ml 0,1% -ig gelatinlösning, kombinera 200 ml destillerat vatten med 0,2 g gelatin. Autoklavera och sval före användning.
2. Beläggningsvävnadsodlingsplattor
- Cirka 2 timmar före cellisolering, tillsätt tillräckligt 0,1% gelatin för att täcka en vävnadsodlingsskål (100 mm) och inkubera vid 37 ° C i en cellodlingsinkubator.
OBS: Dessa plattor kan också göras i förväg och hålls i inkubatorn före användning.
3. Göra Enzymlösning för Dissociation
- Cirka 30 min före cellisolering, väg upp10 enheter dispas på en balans baserat på enheter per milligram koncentration på flaskan. Placera pulvret i en 15 ml koniska rör med 10 ml Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) och placera i ett 37 ° C vattenbad.
4. Göra cellodlingsmedium
- För att göra 50 ml av villkorad omprogrammering mediet, blanda följande ingredienser i ett sterilt koniskt rör: 35 ml F12 (Hams Medium), 11,5 ml DMEM, 0,5 ml L-glutamin, 0,5 ml 100x penicillin / streptomycin, 2,5 ml av fetalt bovint serum (FBS), 250 | ig av humant insulin, 500 ng av human epidermal tillväxtfaktor (EGF).
- För att göra 500 ml 3T3-medium, blanda 50 ml av FBS, 5 ml 100x penicillin / streptomycin och 5 ml av L-glutamin med 500 ml DMEM.
- För att göra 500 ml keratinocyt serumfritt medium, tina EGF och bovinslemavsöndrande extrakt (BPE) kompletterar (medföljer media). Tillsätt tillägg till 500 ml flaska basmediet och tillsätt 5 ml 100x penicillin / streptomycin
5. Odling och bestråla 3T3-celler som en matare Källa
- Förbereda 3T3 medium, innefattande DMEM, 10% FBS, 1x penicillin / streptomycin och 2 mM L-glutamin.
- Kultur 3T3-celler i vävnadsbehandlade T-75 flaskor minst 3 dagar före ankomsten av patientprover.
- Strax före ankomsten av patientprover, trypsinize 3T3-celler med användning av 5 ml av 0,25% Trypsin-EDTA per kolv och inkubera vid 37 ° C under 5 min eller till dess att de flesta celler är flytande
- Tillsätt 5 ml av 3T3-medium för att stoppa reaktionen. Aspirera cellsuspensionen och överför till en 15 ml koniska rör. Spinn under 5 min vid 300 x g.
- Aspirera mediet och återsuspendera cellerna i en definierad volym av trypanblått för cellräkning. Kombinera 10 mikroliter av celler med 10 mikroliter av trypanblått för att utesluta döda celler. Belastning 10 mikroliter av denna lösning på en hemocytometer för cellräkning.
OBS: För denna protocol, är såddtäthet för bestrålade 3T3-celler 10.900 celler per cm 2, vilket är lika med 600000 celler per 100 mm platta. - Alikvotera antalet celler som krävs för att plätera ett 100 mm platta per patientprov och återsuspendera i 25 ml 3T3-medium i en 50 ml koniska rör och bestråla med 3000 rad.
- Efter bestrålning, spin-celler ner under 5 minuter vid 300 xg och återsuspendera i villkor omprogrammering medium vid 5 ml per 100 mm platta.
- Ställ röret åt sidan tills den plätering av patientens celler sker senare i protokollet (se steg 7,6).
6. Anskaffning, bevara och transportera Pediatric Esofagus Biopsier
- Tillsätt 5 ml av komplett keratinocyt serumfritt medium med 100 mikrogram / ml primocin till 15 ml koniska rör och föra den till sjukhus på is.
OBS: Dessa rör av medium kan förvaras vid 4 ° C i upp till 2 månader. - Erhålla cirka 8 esofagus biopsier på timig om endoskopi och separat enligt följande:
- Placera sex biopsier i 15 ml koniska innehåller fullständiga keratinocyt serumfritt medium med 100 mikrogram / ml primocin och plats på våt is.
- Placera en biopsi i 5 ml formalin och plats på våt is.
- Placera en biopsi på en liten biopsi cryomold med optimal skärtemperaturförening.
- Omedelbart släppa denna form i en bägare med isopentan placeras i flytande kväve. När frysta, placera cryomold i ett prov påse och förvara på torr is i en polystyrenskum behållare.
- Placera rören innehåller biopsier i medium eller formalin i en förslutningsbar påse och sedan i en transportlåda som innehåller våt is. Täta och märka låda med en biologiskt etikett och transportera det till laboratoriet.
OBS: Behållaren som innehåller torris och fryst biopsi också slutna och märkta med en biologiskt etikett.
7. BehandlingPatient Tissue för Nedströms kultur och analys
- Vid ankomsten till laboratoriet, överföra den frusna biopsi på torris till -80 ° C frys för nedströms sektionering eller RNA-extraktion. Placera provet i formalin. Förvara i en 4 ° C kylskåp och låt fixa över natten.
- Snurra återstående biopsier ner vid 300 xg, och aspirera mediet. Tillsätt 10 ml dispas lösning på det koniska röret, försegla och låt det inkubera vid 37 ° C i ett vattenbad under 15 min.
- Efter inkubationen snurra biopsier ned vid 300 x g. Aspirera medel och slamma biopsier i 5 ml 0,05% trypsin-EDTA.
- Överför 5 ml trypsin-EDTA innehållande biopsier till en 100 mm steril platta och finhacka biopsier använder 2 steriliserade rakblad så bra som möjligt.
- Överför 5 ml trypsin-EDTA innehållande malet biopsier till en ny 15 ml koniska. Skölj plattan två gånger med ytterligare 5 ml av 0,05% Trypsin-EDTA och lägg till den koniskarör. Inkubera röret under 10 min i ett 37 ° C vattenbad.
- Efter inkubationen snurra biopsier ner vid 300 xg (1,4 rpm) under 5 min och aspirera mediet. Tillsätt 5 ml villkorlig omprogrammering medium till det koniska röret samt 5 ml villkorlig omprogrammering medium innehållande de bestrålade matarceller (se steg 5.7).
- Lägga ROCK-inhibitor (1 | il / ml) till 10 ml cellsuspension och plattan efter aspire gelatinet från vävnadsodlingsskål. Inkubera vid 37 ° C.
8. Odling och växande celler
- Efter cirka 5 dagars odling, aspirera första mediet innehållande finfördelat biopsi bitar och skölj skålen 2-3 gånger med 5 ml steril PBS. Lägg nytt medium till plattan inklusive ROCK-hämmare vid 10 ^ M.
- Vid ankomsten till 70% konfluens, expandera cellerna. Tillsätt 5 ml 0,05% trypsin-EDTA till plattan och inkubera i en 37 ° C inkubator inte mer än 2,5 min för att avlägsna the matarceller. Till följd av denna inkubation, aspirera trypsin-EDTA och skölj plattan med 5 ml PBS.
- Aspirera PBS och tillsätt 5 ml 0,25% trypsin-EDTA till plattan och inkubera i 5-10 min eller tills cellerna är lösa från plattan. Lägga lika stora mängder av medium till plattan för att stoppa reaktionen och överföra all den fluid till en 50 ml koniska rör och spinn ner vid 300 xg under 5 min.
- Resuspendera celler i en definierad volym av villkorad omprogrammering medelstora och blanda 10 mikroliter av suspensionen med 10 mikroliter av trypanblått. Räkna med en hemocytometer för att bestämma totala cellantalet.
- Att expandera celler, tillsätt 1 miljon humana esofagus celler till en 150 mm platta tillsammans med 1,2 miljoner bestrålade 3T3-celler i en total volym av 15 ml. Lägg färsk ROCK-hämmare vid 10 | iM och tillsätt cellsuspension till en gelatinbelagd 150 mm skål.
9. Freeze och Store Human Esophageal epitelceller
- För att göra frysmedium, tillsätt 10%DMSO villkorad omprogrammering medium. Efter trypsinizing och räkning, alikvot cellerna att frysa in i en ny 50 ml koniska rör och spinn ner vid 300 xg under 5 min.
- Aspirera mediet och tillsätt frysmedium vid en volym av 2 ml per cryovial. När cellsuspensionen är homogen, portion 10 6 celler i pre-märkta cyrovials. Placera i en frysbehållare vid -80 ° C under minst 24 timmar innan du flyttar flaskorna till långsiktig flytande kväve lagring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En sammanfattning av de viktigaste stegen i att isolera esofagus epitelceller från patientbiopsier sammanfattas i figur 1. Kolonier av epitelceller bildas i ungefär 4-5 dagar och kommer att omges av fibroblast feeder-celler (Figur 2A). Eftersom dessa kolonier expandera de kommer att slås samman med andra kolonier att bilda större kolonier (Figur 2B). När kulturerna har blivit 70% sammanflytande, måste de utökas (figur 2C). För att säkerställa att fibroblaster avlägsnas från plattan före avlägsnande epitelcellerna, är 0,05% trypsin-EDTA användas i upp till 2,5 minuter för att avlägsna matare. Frånvaron av matare bör likna figur 2D. De vidhäftande epitelceller sedan trypsin med 0,25% Trypsin-EDTA och ströks åter ut på nya bestrålade matarceller (Figur 2E).
(figur 3A ). Dessa celler analyserades också vid passage 1 för epiteliala markörer via flödescytometri och större än 90% av de celler som finns från tre patienter var positiva för EpCAM (figur 3B). Celler analyserades också genom immunofluorescens vid passagerna 1 och 3 att säkerställa fenotypen över de 3 passager inte förändras. Färgningen visar ihållande epitel markör E-cadherin (Figur 4A-D), stamfader markör P63 (Figur 4E-H), proliferation markör KI-67 (Figur 4I-L) och epitel tight junction protein TJP1 (Figur 4M-P ).
Slutligen har en tillväxtkurva ritas med användning av en cellinje från en icke-sjuk patient att utvärdera fördubblingstiden för dessa celler i villkor omprogrammering kultur. Celler ströks ut med 100.000 celler vid dag 0 och befanns vara bara något över 500.000 celler vid dag 4 (fig 5). Fördubblingstiden beräknades vara cirka 36-40 timmar. Det förväntas att sjuka celler kommer att ha en långsammare dubbleringstid bör emellertid varje patient bedömas separat för att redovisa individuella skillnader.
1 ">
Figur 1: Översikt över Isolering och odling av humana Esophageal epitelceller från Pediatric biopsier. Biopsier erhålls från pediatriska patienter efter informerat samtycke och transporteras i keratinocyt serumfritt medium till labbet. Dessa biopsier behandlas sedan med 1 U / ml dispas, följt av hackning av vävnaden med sterila rakblad och slutligen behandling med 0,05% trypsin-EDTA. Cellsuspensionen sedan till bestrålade matarceller i villkor omprogrammering medium. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Odling och utöka Human Esophageal epitelceller. Efter 5 dagar i villkorlig Programmeraming medium, esophageal epitelceller börjar bildas små gatsten kolonier (A), som så småningom konvergerar för att bilda större kolonier (B). När väl vävnadsodlingsskål når 70% konfluens (C) är plattorna behandlas för en mycket kort tid med 0,05% trypsin-EDTA för att avlägsna matarceller, och samtidigt bibehålla vidhäftningen av epitelceller (D). Epitelcellerna avlägsnas sedan med 0,25% trypsin-EDTA och lades åter ut med nya matarceller. Bara 24 timmar efter att dela dessa celler de kommer att bilda nya kolonier och fortsätter att föröka sig (E). Förstoringen är 100X. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Flödescytometri och QRT-PCR Analys av celler expanderas i odling. (A) Representativa genuttrycket av celler i odling vid passage ett av villkorad omprogrammering visade en 6-faldig ökning i P63 uttryck, en markör av progenitorceller såväl som en minskning av epiteliala markörer CDH1 och TJP1 jämfört med biopsi genuttryck. Detta indikerar cellpopulationen är i en mer gångarliknande tillstånd och därför är högre proliferativ. Genuttryck 24 h post-omprogrammering (efter avlägsnande av matarceller och ROCK Inhibitor) visar ökad CDH1 och TJP1 uttryck men en minskning i P63-uttryck. (B) Flödescytometri analys av celler från flera patienter som erhållits vid passage 1 visar mer än 90% av de celler som uttrycker EpCAM. Patient 27 representerar icke-EOE patientceller, medan Patienter 26 och 28 är EOE patientceller. Klicka här to se en större version av denna siffra.
Figur 4: Immunofluorescens färgning av celler vid Passages 1 och 3. Celler odlade i villkor omprogrammering medium med bestrålade matarceller uttryck E-cadherin (A - D) samt progenitor markör P63 (E - H). Dessa celler är fortfarande proliferativ vid passage 3 (I - L). Slutligen är dessa celler uttrycker tight junction protein 1 (TJP1), som också är i överensstämmelse med en epitelial fenotyp (M - P). Kärnor motfärgades med DAPI (blå) och antikroppar detekteras med hjälp av en Alexa Fluor 546 antikropp (Orange). 2 nd Antikropp (Ab) kontroll representerar icke-specifik bindning av den sekundära antikroppen till vävnaden (Q, R). Skalstrecken = 50um. Förstoringen är 200X. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: tillväxtkurva av celler i villkorad omprogrammering. Celler i villkor omprogrammering medium från en icke-sjuk patienten såddes vid en definierad densitet och replikerar av tre räknades varje dag under 4 dagar. Tillväxtkurvan genererades med hjälp av dessa kroppar och fördubblingstid beräknades baserat på antalet erhållna på dag fyra och dag 0. fördubblingstiden för dessa celler är ca 36-40 timmar. Felstaplar indikerar standardfel. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De viktigaste stegen för att isolera och expandera esofagus epitelceller från patientbiopsier är: 1) på lämpligt sätt dissociera biopsivävnad med minimal celldöd; 2) säkerställa ROCK-inhibitor tillsätts till cellodlingsmediet vid varje mediumbyte; 3) Använd inte fler matarceller än rekommenderas; 4) upprätthålla en ren aseptisk kultur; och 5) passage celler strax före att nå sammanflödet.
På grund av de patientrelaterade skillnader i biopsiprover erhållna för villkorlig omprogrammering, är det rimligt att förvänta sig skillnader i tillväxt kinetik, fenotyp och förmåga att expandera till flera passager. Normalt är 4 matstrupen biopsier från varje patient för cellisolering. När skiljas, vi netto cirka 300,000-600,000 celler vid dag 0. Detta expanderar till över 10 miljoner celler genom passage 3 i genomsnitt. Morfologi kolonier som bildar bör likna kullersten morfologi beskrivs för epitelcellinjer <sup class = "xref"> 25 (Figur 2). Ett prov av celler i odling bör analyseras via QRT-PCR, flödescytometri och immunofluorescens för epiteliala markörer för att säkerställa befolkningen expanderar verkligen epitelialt ursprung (Figur 3). Bör cellerna inte uttrycka epiteliala markörer (E-cadherin, EpCAM, TJP1), bör cellinjen avslutas och kasseras. Det förväntas att mer än 90% av de celler som är närvarande är EpCAM positiva om de är epiteliala ursprung. För att utvärdera om kulturerna ändrar fenotyp eller förlora epitel uttryck, immunofluorescens eller flödescytometri bör användas för att utvärdera epiteliala markörer (E-cadherin), stamfader uttryck (P63), och epitelceller Täta fogar proteiner (TJP1). Som cellerna passe det förväntas att fenotypen inte bör förändras, bör proliferation inte minska och dessa celler bör uppvisa epitelial uttryck samt progenitor expression (Figur 4 (figur 5). Celler som finns inte att fördubbla mer än 5 dagar kommer sannolikt att vara åldrande och ska kasseras.
Det har beskrivits att celler som isolerats från patienter med inflammatoriska processer förekommer, t.ex. EoE, besitter epitelceller som har en minskad proliferativ hastighet, minskad E-cadherin-uttryck (figur 3, patienter 26 och 28) och en hög grad av apoptos 26. Därför är det inte orimligt att ha svårt att odla celler från en allvarligt sjuk patient med denna metod. Det är möjligt att celler bara tål några passager eller bara första passagen. Detta bör ändå ge undersökaren med ett större antal celler än vad som ursprungligen isolerad. Emellertid kan detta antal vara olämpligaför alla föreslagna studier. Eftersom dessa celler används för att slutligen studera matstrupen sjukdom eller konstruera en matstrupen ersättning, är det viktigt att komma ihåg dessa celler är bara ansvarig för mucosal regenerering. Andra celltyper såsom fibroblaster, neuroner, glatta muskelceller och blodkärl är också lika viktigt att studiet av matstrupen sjukdom och för vävnadstekniska tillämpningar.
Denna teknik erbjuder en patientspecifik cellkälla som är ett ovärderligt verktyg för att studera sjukdomen patogenes samt fungerar som en potentiell reservoar av patientspecifika celler för esofagealvävnad tekniska tillämpningar. Celler som används för sådd biomaterial för kirurgisk implantation måste vara fri från genetiska avvikelser, virala sekvenser och inte bilda teratom. Användningen av stamceller (multi eller pluripotenta) genererar alltför många oönskade celltyper efter differentiering, varav en del kan bilda teratom om de inte genomgå differenfinfördelning på djupet. Dessutom är denna cellkälla fenotyp förenlig och inte kräver rening eller avlägsnande av oönskade celler. Den ideala cellkälla kommer att vara celler som finns i samma anatomiska plats som håller på att engineered. I detta tillvägagångssätt dessa esofagus epitelceller som används för att återbefolka slemhinnan av en esofagus byggnadsställning. Ytterligare celltyper behövs för matstrupen regeneration; var dock i fokus för denna teknik för att säkerställa slemhinna reseeded och inte ofullständigt eftersom detta kan leda till läckage, förträngning och perforering.
Förutom att använda dessa celler för konstruktion nya kirurgiska alternativ för matstrupen, kan dessa celler också användas för att studera esofagus sjukdomsprocesser samt skärmen för nya terapeutiska metoder för att behandla dessa tillstånd. Eosinofil esofagit (EoE) beskrivs som en allergisk sjukdom i matstrupen, med den exakta mekanismen och patogenes ännu inte är fullt beskrivna. Nuvarande behandling regiments inkluderar utslagningdieter, orala steroider och flera endoskopier. Ingen analys existerar för att utvärdera vad som utlöser den inflammatoriska processen för varje patient, vilket leder läkare att använda en "gissning och kontrollera" tillvägagångssätt som är lång och ofta frustrerande för patienten. Eftersom denna metod för patientspecifik cellexpansion inte använder Lentiviral transduktion eller genetisk modifiering, är möjligheten att permanenta förändringar i genotypen av cellerna från omprogrammering processen minimal. Detta innebär att celler förblir teoretiskt oförändrade jämfört med in vivo miljö. Förmågan att testa patientceller in vitro för att identifiera den triggmedlet skulle vara nytt och kunde slutligen leda till utveckling av nya diagnostik eller terapeutiska medel för dessa pediatriska patienter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
