Summary
Expansion des cellules épithéliales humaines oesophagiennes pédiatriques en utilisant la reprogrammation conditionnelle fournit aux enquêteurs avec une population spécifique au patient des cellules qui peuvent être utilisées pour l'ingénierie des constructions oesophagiennes pour l'implantation autologue pour traiter des défauts ou des blessures et servir de réservoir pour des essais de criblage thérapeutique.
Introduction
ingénierie tissulaire oesophagien et éosinophiles oesophagite (EoE) ont fait l'objet de la recherche dans de nombreux laboratoires au cours de la dernière décennie. Malformations congénitales, telles que atrésie de l' œsophage, sont observés chez environ 1 sur 4000 naissances vivantes, ce qui se traduit dans le développement incomplet de l'oesophage menant à l'incapacité de manger 1. L'incidence et la prévalence de EoE ont été à la hausse depuis l'identification de l'entité de la maladie en 1993. L'incidence de EoE variait de 0,7 à 10 / 100.000 par année-personne et la prévalence variait de 0,2 à 43 / 100.000 2. Une nouvelle approche chirurgicale attrayant pour le traitement à long gap atrésie de l'œsophage consiste à générer des constructions de tissu pour l'implantation en utilisant les propres cellules du patient. Ces cellules en association avec des échafaudages synthétiques vont générer une construction autologues qui ne nécessite pas la suppression immunitaire. Certains groupes ont déjà commencé à enquêter sur les États-Unise des cellules souches ressemblant à oesophagien ingénierie tissulaire 3, ainsi que l'utilisation de cellules épithéliales de l' œsophage natifs pour repeupler la muqueuse 4-7. Les maladies qui sont présents dans l'oesophage des patients pédiatriques sont souvent difficiles à diagnostiquer ou étudier sans intervention. En outre, les modèles animaux utilisant ou in vitro immortalisés modèles de lignées cellulaires pour les maladies pédiatriques comme EoE n'englobent la pathogenèse de la maladie exacte ou des différences spécifiques aux patients 8. Par conséquent, la possibilité d'étudier le processus de la maladie d'un patient in vitro afin d'identifier des antigènes de la maladie de déclenchement spécifiques, évaluer les mécanismes sous - jacents et d' enquêter sur les traitements médicamenteux serait nouveau et fournir aux cliniciens des informations qui peuvent aider dans le traitement des patients.
Il y a eu de nombreux types de cellules autologues ou spécifiques à un patient qui ont été proposés pour une utilisation en tissuingénierie e et étudier la pathogenèse de la maladie humaine. Toutefois, certains de ces types de cellules sont limitées dans leur capacité à générer suffisamment de cellules d'un phénotype spécifique pour ensemencer un grand échafaudage ou d' effectuer un débit élevé des études in vitro. L'utilisation de cellules souches pluripotentes ou multipotentes a été le sujet de discussion de recherche beaucoup, cependant, les limites et les lacunes pour l' utilisation de ces cellules ont été bien décrits 9. L'utilisation de cellules souches embryonnaires humaines est fortement débattue et présente de nombreuses questions éthiques. Plus important encore , ces cellules forment des tératomes, qui sont semblables à une tumeur, si elles ne sont pas différenciés de leur état pluripotentes avant de les livrer dans un hôte vivant 10. En outre, l'utilisation de cellules souches embryonnaires ne serait pas le patient spécifique et peut déclencher une réponse allogénique et la nécessité d' une suppression immunitaire 10. Les cellules souches pluripotentes induites (CISP) sont des cellules pluripotentes qui peuventdériver à partir des cellules d'un patient. des cellules somatiques telles que les cellules de la peau, peuvent être amenés à un état pluripotent en utilisant une variété de techniques d'intégration et de non-intégratifs. Ces cellules servent alors comme une source de cellules spécifiques au patient pour l'ingénierie tissulaire ou d'une enquête de la maladie. L'intégration du matériel génétique indésirable dans ces cellules est une préoccupation beaucoup ont décrit et même si les séquences sont complètement CSPi enlevés semblent conserver une "mémoire" épigénétique vers le type de cellule à partir de laquelle ils sont dérivés 11. Ces cellules vont également former des tératomes in vivo si non différenciée avant la transplantation 11. De nombreux protocoles de différenciation ont été étudiés en se concentrant sur les lignées épithéliales 12, 13, 14, cependant, il est très important de noter que les types cellulaires résultantes à la fin de la différenciation ne sont pas homogènes et oeul possèdent une fraction du type cellulaire d'intérêt. Cela se traduit par un faible rendement et la nécessité de purifier le type cellulaire souhaité. Bien que CSPi sont une source potentielle de cellules spécifiques au patient, le processus pour obtenir un type d'intérêt soit pour l'ingénierie tissulaire ou d'une enquête de la maladie cellulaire est très inefficace.
Des cellules épithéliales humaines ont été isolées avec succès à partir d' une variété de deux tissus malades et non malades dans le corps humain , y compris: 15 poumon, du sein 16, l' intestin grêle 17, 18 côlon, de la vessie et de l' œsophage 19 20. Il est important de noter que les cellules humaines primaires ont un nombre fini de passages dans lesquels le phénotype est maintenu 21, 22. Malheureusement, cela signifie que le nombre de cellules nécessaires pour la recherche de la maladie ou pour l'ensemencement d'un échafaudage d'ingénieriepour l'implantation ne peut pas être atteint. Par conséquent, de nouvelles techniques sont nécessaires pour étendre les cellules du patient, tout en conservant un phénotype épithélial. Reprogrammation conditionnelle des cellules épithéliales normales et cancéreuses en utilisant des cellules nourricières et inhibiteur de ROCK a été décrite en 2012 par Liu et al. 2 3. Cette technique a été utilisée pour développer des cellules épithéliales cancéreuses obtenues à partir de biopsies de la prostate et le cancer du sein en utilisant des cellules nourricières irradiées, inhibiteurs de ROCK et moyennes de reprogrammation conditionnelle. L'objectif était de générer suffisamment de cellules pour des tests in vitro tels que le dépistage des drogues. Cette technique est capable de se dilater par les cellules épithéliales indéfiniment "reprogrammation" de ces cellules à une tige ou à l'état géniteur analogue, ce qui est très proliférative. Il a été démontré que ces cellules sont non tumorigènes et ne possèdent pas la capacité de former des tératomes 23, 24. En outre, aucundes anomalies chromosomiques ou les manipulations génétiques étaient présents après repiquage ces cellules en culture en utilisant cette technique 23, 24. Plus important encore, ces cellules ne sont capables de se différencier dans le type cellulaire natif d'intérêt. Par conséquent, cette technique offre un grand réservoir de cellules épithéliales spécifiques au patient pour enquête sur la maladie ou l'ingénierie tissulaire, sans la nécessité d'immortalisation.
L'obtention d'un tissu épithélial d'un organe spécifique afin d'étudier les processus de la maladie est souvent limitée et pas toujours possible en raison du risque patient. Pour les patients souffrant d'une maladie de l'oesophage ou de défauts, la récupération de biopsie endoscopique est une approche mini-invasive pour l'obtention d'un tissu épithélial qui peut être dissocié et conditionnellement reprogrammé pour fournir une source de cellules indéfinie qui est spécifique à la muqueuse de l'oesophage du patient. Ceci permet alors d'études in vitrodes cellules épithéliales pour évaluer les processus de la maladie et l'écran pour thérapeutiques potentiels. Un processus de la maladie qui pourrait grandement bénéficier de cette approche est éosinophile oesophagite, qui a été décrit comme une maladie allergique de l'œsophage 8. Des tests d'allergie ainsi que des approches thérapeutiques pourraient être évalués in vitro en utilisant les propres cellules épithéliales du patient et ces données peuvent ensuite être transférés sur le médecin traitant pour élaborer des plans de traitement individualisés. La technique de reprogrammation conditionnelle en combinaison avec l'obtention de biopsies endoscopiques chez des patients pédiatriques offre la possibilité d'étendre les cellules épithéliales normales de l'œsophage chez un malade indéfiniment. Cette source de la cellule pourrait donc être associé avec des échafaudages naturels ou synthétiques pour fournir une option chirurgicale spécifique au patient pour des défauts, d'une maladie ou d'un traumatisme. Avoir un nombre de cellules indéfinie permettrait ingénieur des constructions oesophagiennes qui possèdent un tout réensemencéeslumen avec les cellules épithéliales de l'œsophage, afin de contribuer à faciliter la régénération des types de cellules restantes.
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Protocol
biopsies oesophagiennes ont été obtenus après le consentement éclairé a été obtenu à partir des parents / tuteurs des patients pédiatriques et en conformité avec comité d'examen institutionnel (IRB # 13-094).
1. Instruments stérilisant et Gélatine Solution
- forceps autoclaves, lames de rasoir et des ciseaux avant tissus de manutention pour éviter la contamination.
- Pour 200 ml de solution de gélatine à 0,1%, mélanger 200 ml d'eau distillée avec 0,2 g de gélatine. Autoclave et refroidir avant de l'utiliser.
2. Coating Tissue Culture Plaques
- Environ 2 h avant l'isolement des cellules, ajouter suffisamment de 0,1% de gélatine pour couvrir une boîte de culture tissulaire (100 mm) et on incube à 37 ° C dans un incubateur de culture cellulaire.
REMARQUE: Ces plaques peuvent également être faits à l'avance et conservées dans l'incubateur avant de les utiliser.
3. Faire Enzyme Solution pour Dissociation
- Environ 30 minutes avant l'isolement des cellules, pesez10 unités de dispase sur une balance sur la base des unités par milligramme de concentration sur le flacon. Placer la poudre dans un tube de 15 ml conique avec 10 ml de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) et placer dans un bain d'eau à 37 ° C.
4. Making milieu de culture cellulaire
- Pour 50 ml de milieu de reprogrammation conditionnelle, mélanger les ingrédients suivants dans un tube stérile conique: 35 ml de F12 (Ham moyenne), 11,5 ml de DMEM, 0,5 ml de L-glutamine, 0,5 mL de 100x pénicilline / streptomycine, 2,5 ml de sérum de fœtus bovin (FBS), 250 ug d'insuline humaine, 500 ng de facteur de croissance épidermique humain (EGF).
- Pour 500 ml de 3T3 moyen, mélanger 50 ml de FBS, 5 ml de 100x pénicilline / streptomycine et 5 ml de L-glutamine avec 500 ml de DMEM.
- Pour 500 ml de milieu sans sérum kératinocytes, dégeler EGF et de l'extrait d'hypophyse bovine (BPE) suppléments (fournis avec les médias). Ajouter les suppléments au ml bouteille de milieu de base 500 et ajouter 5 ml de 100x pénicilline / streptomycine
5. la mise en culture et en irradiant cellules 3T3 comme un chargeur Source
- Préparer le milieu 3T3, comprenant en DMEM 10% de FBS, 1 x pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine.
- Culture des cellules 3T3 dans les tissus traités flacons T-75 au moins 3 jours avant l'arrivée des échantillons de patients.
- Juste avant l'arrivée des échantillons de patients, en utilisant des cellules 3T3 trypsiniser 5 ml de 0,25% de trypsine-EDTA par flacon et incuber à 37 ° C pendant 5 minutes ou jusqu'à ce que la plupart des cellules sont flottantes
- Ajouter 5 ml de 3T3 moyen pour arrêter la réaction. Aspirer la suspension cellulaire et le transférer vers un tube de 15 ml conique. Spin pendant 5 min à 300 x g.
- Aspirer le milieu et remettre en suspension les cellules dans un volume défini de bleu trypan pour le comptage des cellules. Combiner 10 pi de cellules avec 10 pi de bleu trypan pour exclure les cellules mortes. Charge 10 pi de cette solution sur un hémocytomètre pour le comptage des cellules.
NOTE: Pour cette protocol, la densité d'ensemencement des cellules 3T3 irradiés est de 10.900 cellules par cm2, ce qui est égal à 600.000 cellules par plaque de 100 mm. - Aliquoter le nombre de cellules nécessaires à la plaque d'une plaque de 100 mm par échantillon du patient et remettre en suspension dans 25 ml de milieu 3T3 dans un tube de 50 ml conique et irradier avec 3000 rads.
- irradiation Après, les cellules de spin bas pendant 5 min à 300 xg et resuspendre dans un milieu de reprogrammation conditionnelle à 5 ml par plaque de 100 mm.
- Réglez le tube de côté jusqu'à le placage des cellules du patient a lieu plus tard dans le protocole (voir étape 7.6).
6. Obtention, conservation et de transport pédiatrique oesophagiennes Biopsies
- Ajouter 5 ml de milieu sans sérum kératinocytes avec 100 pg / mL primocin 15 tubes coniques mL et l'amener à l'établissement médical sur la glace.
REMARQUE: Ces tubes de support peuvent être stockés à 4 ° C pendant jusqu'à 2 mois. - Obtenir environ 8 biopsies œsophagiennes au timoi de l'endoscopie et séparée comme suit:
- Placez six biopsies dans le cône 15 ml contenant du milieu sans sérum de kératinocytes avec 100 pg / mL primocin et le placer sur la glace mouillée.
- Placer une biopsie dans 5 ml de formol tamponné et le placer sur la glace mouillée.
- Placez une biopsie dans une petite biopsie cryomoule avec optimal composé de température de coupe.
- Abandonner immédiatement ce moule dans un bécher d'isopentane placé dans de l'azote liquide. Une fois congelé, placez le cryomoule dans un sac de spécimen et stocker sur la glace sèche dans un récipient en mousse de polystyrène.
- Placer les tubes contenant des biopsies dans le milieu ou le formol dans un sac refermable, puis dans une boîte d'expédition contenant de la glace humide. Sceller et étiqueter la boîte avec une étiquette de biohazard et le transporter au laboratoire.
NOTE: Le conteneur qui contient la glace sèche et la biopsie congelée est également scellé et étiqueté avec une étiquette de biohazard.
7. traitementTissu du Patient pour la culture et l'analyse en aval
- À l'arrivée au laboratoire, transférer la biopsie congelés sur glace sèche à -80 ° C congélateur pour la coupe en aval ou l'extraction d'ARN. Placer l'échantillon dans le formol. Conserver dans un 4 ° C réfrigérateur et permettre de fixer une nuit.
- Faites tourner les biopsies restantes vers le bas à 300 xg, et aspirer le milieu. Ajouter 10 ml de dispase solution au tube conique, sceller et laisser incuber à 37 ° C dans un bain-marie pendant 15 min.
- Après l'incubation, tourner les biopsies vers le bas à 300 x g. Aspirer les moyennes et resuspendre biopsies dans 5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA.
- Transférer le 5 ml de trypsine-EDTA contenant les biopsies à une plaque stérile de 100 mm et émincer les biopsies à l'aide de 2 lames de rasoir stérilisées aussi fine que possible.
- Transférer le 5 ml de trypsine-EDTA contenant des biopsies émincées à un nouveau ml conique 15. Rincer la plaque deux fois avec un 5 ml de plus de 0,05% de trypsine-EDTA et ajouter à la partie coniquetube. Incuber le tube pendant 10 minutes dans un bain-marie à 37 °.
- Après l'incubation, tourner les biopsies vers le bas à 300 xg (1,4 RPM) pendant 5 min et aspirer le milieu. Ajouter 5 ml de milieu de reprogrammation conditionnelle au tube conique, ainsi que le 5 mL de milieu de reprogrammation conditionnelle contenant les cellules nourricières irradiées (voir étape 5.7).
- Ajouter un inhibiteur de roche (1 pl / ml) à 10 ml de suspension cellulaire et de la plaque après l'aspiration de la gélatine de la capsule de culture tissulaire. Incuber à 37 ° C.
8. La culture et les cellules expansibles
- Après environ 5 jours de culture, aspirez le milieu initial contenant les morceaux hachés-biopsie et rincer le plat 2-3 fois avec 5 ml de PBS stérile. Ajouter un nouveau moyen à la plaque y compris inhibiteur de ROCK à 10 uM.
- Après avoir atteint 70% de confluence, développez les cellules. Ajouter 5 ml de 0,05% de trypsine-EDTA à la plaque et incuber dans un incubateur à 37 ° pas plus de 2,5 min pour éliminer les edes cellules nourricières e. À la suite de cette incubation, aspirer le trypsine-EDTA et rincer la plaque avec 5 ml de PBS.
- Aspirer le PBS et ajouter 5 ml de 0,25% de trypsine-EDTA à la plaque et incuber pendant 5-10 minutes ou jusqu'à ce que les cellules sont lâches de la plaque. Ajouter des quantités égales de moyenne à la plaque pour arrêter la réaction et de transférer la totalité du fluide à un tube de 50 ml conique et centrifuger à 300 xg pendant 5 min.
- Resuspendre les cellules dans un volume déterminé de milieu de reprogrammation conditionnel et mélanger 10 ul de la suspension avec 10 pi de bleu trypan. Comptez sur un hémocytomètre pour déterminer le nombre total de cellules.
- Pour développer des cellules, ajouter 1 million de cellules humaines de l'œsophage à une plaque de 150 mm avec 1,2 million irradier des cellules 3T3 dans un volume total de 15 ml. Ajouter inhibiteur de ROCK fraîche à 10 uM et ajouter la suspension cellulaire à un 150 mm plat revêtu de gélatine.
9. Cellules congeler et conserver Human oesophagien épithéliales
- Pour un milieu de congélation, ajouter 10%DMSO à un milieu de reprogrammation conditionnelle. Après trypsinisation et comptage, aliquoter les cellules de geler dans un nouveau tube de 50 ml conique et centrifuger à 300 xg pendant 5 min.
- Aspirer le moyen et ajouter le milieu de congélation à un volume de 2 ml par cryovial. Une fois que la suspension cellulaire est homogène, aliquote de 10 6 cellules cyrovials pré-étiquetés. Placer dans un récipient de congélation à -80 ° C pendant au moins 24 heures avant le déplacement des flacons de stockage d'azote liquide à long terme.
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Representative Results
Un résumé des principales étapes de l' isolement des cellules épithéliales de l' œsophage de biopsies de patients est résumée à la figure 1. Les colonies de cellules épithéliales se formeront dans environ 4-5 jours et seront entourés par des cellules nourricières de fibroblastes (figure 2A). Etant donné que ces colonies élargissent leur fusion avec les autres pour former des colonies plus grandes colonies (figure 2B). Une fois que les cultures sont devenues 70% confluentes, ils doivent être élargis (figure 2C). Faire en sorte que les fibroblastes sont éliminés de la plaque avant d'enlever les cellules épithéliales, 0,05% de trypsine-EDTA est utilisé pour un maximum de 2,5 min pour éliminer les mangeoires. L'absence de mangeoires doit ressembler à la figure 2D. Les cellules épithéliales adhérentes sont ensuite trypsinisées avec 0,25% de trypsine-EDTA et replaqué sur les nouvelles cellules nourricières irradiées (figure 2E).
(figure 3A ). Ces cellules ont également été analysées au passage 1 pour les marqueurs épithéliaux par cytométrie de flux et plus de 90% des cellules présentes sur trois patients étaient positifs pour EpCAM (figure 3B). Les cellules ont également été analysées par immunofluorescence aux passages 1 et 3 pour assurer le phénotype sur ces 3 passages ne changeait pas. La coloration démontre la persistance de marqueur épithélial E-cadhérine (figure 4A-D), marqueur progéniteur P63 (Figure 4E-H), marqueur de prolifération KI-67 (Figure 4E-L) et épithéliales TJP1 de protéine de jonction serrée (Figure 4M-P ).
Enfin, une courbe de croissance a été tracée en utilisant une lignée cellulaire provenant d'un patient non malade pour évaluer le temps de doublement des cellules dans une culture de reprogrammation conditionnelle. Les cellules ont été étalées à raison de 100.000 cellules au jour 0 et ont été trouvés pour être juste un peu plus de 500 000 cellules au jour 4 (figure 5). Le temps de doublement a été calculée à environ 36-40 h. Il est prévu que les cellules malades ont un temps de doublement lent, cependant, tous les patients doivent être évalués séparément pour tenir compte des différences individuelles.
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Figure 1: Vue d' ensemble de l' isolement et de cellules humaines en culture oesophagien épithéliales de pédiatrie Biopsies. Les biopsies sont obtenues à partir de patients pédiatriques après consentement éclairé et transportés dans un milieu sans sérum kératinocytes au laboratoire. Ces biopsies sont ensuite traitées avec 1 U / ml de dispase, puis en hachant le tissu avec des lames de rasoir stérile, et enfin à traiter avec 0,05% de trypsine-EDTA. La suspension cellulaire est ensuite ajouté à des cellules nourricières irradiées dans un milieu de reprogrammation conditionnel. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: La culture et expansion des cellules humaines oesophagien épithéliales. Après 5 jours à reprogrammer conditionnellemoyen ming, les cellules épithéliales de l' œsophage commencent à former des colonies petites pavées (A), qui convergent finalement pour former des colonies plus grandes (B). Une fois que la boîte de culture de tissu atteint 70% de confluence (C), les plaques sont traitées pendant un temps très bref avec 0,05% de trypsine-EDTA pour éliminer les cellules nourricières, tout en conservant l'adhérence des cellules épithéliales (D). Les cellules épithéliales sont ensuite éliminés avec 0,25% de trypsine-EDTA et replaqué avec de nouvelles cellules nourricières. Juste 24 h après le fractionnement de ces cellules , ils formeront de nouvelles colonies et continuent à proliférer (E). Grossissement est 100X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: cytométrie de flux et de qRT-PCR Analyse des cellules développées en culture. (A) l' expression du gène représentatif de cellules en culture au passage 1 de la reprogrammation conditionnel a démontré une augmentation de 6 fois de l'expression de P63, un marqueur de cellules progénitrices, ainsi qu'une diminution des marqueurs épithéliaux CDH1 et TJP1 par rapport à l'expression du gène de la biopsie. Cela indique que la population de cellules est dans un état plus progénitrices-like et est plus fortement proliférative donc. L'expression des gènes 24 h post-reprogrammation (après l'élimination des cellules nourricières et ROCK Inhibitor) démontre augmenté CDH1 et TJP1 expression, mais une diminution de l'expression de P63. (B) Analyse par cytométrie de flux de cellules provenant de patients multiples obtenu au passage 1 montrent plus de 90% des cellules exprimant EpCam. Patient 27 représente les cellules des patients non-EOE, tandis que les patients 26 et 28 sont des cellules de patients EOE. S'il vous plaît cliquez ici to voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Immunofluorescence de cellules aux passages 1 et 3. Les cellules cultivées dans un milieu de reprogrammation conditionnel avec des cellules nourricières irradiées express E-cadhérine (A - D), ainsi que le marqueur progéniteur P63 (E - H). Ces cellules sont encore proliférative au passage 3 (I - L). Enfin, ces cellules expriment la protéine de jonction serrée 1 (TJP1), qui est également compatible avec un phénotype épithélial (M - P). Les noyaux sont DAPI (bleu) et les anticorps sont détectés en utilisant un anticorps Alexa Fluor 546 (orange). 2 ème anticorps (Ab) le contrôle représente une liaison non spécifique de l'anticorps secondaire au tissu (Q, R). Barres d'échelle = 50um. Grossissement est 200X. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5: Courbe de croissance des cellules dans Reprogrammation conditionnelle. Cellules dans un milieu de reprogrammation conditionnelle d'un patient non malade ont été ensemencées à une densité définie et réplicats trois ont été comptées chaque jour pendant 4 jours. La courbe de croissance a été générée à l'aide de ces comptages de cellules et de doubler le temps a été calculée sur la base des chiffres obtenus au jour 4 et le jour 0. Le temps de doublement de ces cellules est d'environ 36-40 h. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Les étapes les plus importantes dans le but d'isoler et d'étendre les cellules épithéliales de l'œsophage à partir de biopsies de patients sont: 1) dissociant de manière adéquate le tissu biopsie à la mort cellulaire minimale; 2) assurer un inhibiteur de roche est ajouté au milieu de culture cellulaire à chaque changement de milieu; 3) Ne pas utiliser plus de cellules nourricières que recommandé; 4) maintenir une culture aseptique propre; et 5) les cellules de passage juste avant d'atteindre la confluence.
En raison des différences relatives au patient dans les échantillons de biopsie obtenus pour la reprogrammation conditionnelle, il est raisonnable de prévoir des différences de cinétique de croissance, le phénotype et la capacité d'étendre à de multiples passages. En règle générale, les biopsies de l'oesophage 4 sont obtenues à partir de chaque patient pour l'isolement des cellules. Une fois dissocié, nous net environ 300,000-600,000 cellules au jour 0. Ceci augmente à plus de 10 millions de cellules par passage 3 en moyenne. Morphologie des colonies qui forment doit ressembler à la morphologie pavée décrite pour les lignées cellulaires épithéliales <sup class = "xref"> 25 (Figure 2). Un échantillon de cellules en culture devrait être analysée par qRT-PCR, cytométrie de flux et immunofluorescence des marqueurs épithéliaux pour assurer l' expansion des populations sont effectivement d'origine épithéliale (figure 3). Si les cellules non exprimer des marqueurs épithéliales (E-cadhérine, EpCAM, TJP1), la lignée cellulaire devrait être résilié et jeté. Il est prévu que plus de 90% des cellules sont présentes EpCAM positives si elles sont d'origine épithéliale. Afin d'évaluer si les cultures sont en train de changer le phénotype ou de perdre l'expression épithéliale, immunofluorescence ou par cytométrie de flux devraient être utilisés pour évaluer les marqueurs épithéliales (E-cadhérine), expression progénitrices (P63), et épithéliales des protéines des jonctions serrées (TJP1). Comme les cellules sont repiquées il est prévu que le phénotype ne doit pas changer, la prolifération ne devrait pas diminuer et ces cellules doit afficher l' expression epitheliale ainsi que l' expression des progéniteurs (Figure 4 (figure 5) de doublement de la population. Les cellules qui se trouvent pas à doubler pendant plus de 5 jours sont susceptibles d'être sénescents et doivent être jetés.
Il a été décrit que des cellules isolées à partir de patients présentant des processus inflammatoires présents, tels que EoE, possèdent des cellules épithéliales qui ont un taux proliférante diminué, la diminution de l' expression E-cadhérine (Figure 3, les patients 26 et 28) et un taux élevé de l' apoptose 26. Par conséquent, il est pas déraisonnable d'avoir des cellules de difficulté en culture d'un patient gravement malade en utilisant cette méthode. Il est possible que les cellules ne pourront résister à quelques passages ou même passage que nous venons initial. Cela devrait encore fournir à l'enquêteur un plus grand nombre de cellules que l'origine isolé. Toutefois, ce nombre peut ne pas être suffisantpour toutes les études proposées. Étant donné que ces cellules sont utilisées pour étudier la maladie en fin de compte de l'œsophage ou de la construction d'un remplacement de l'œsophage, il est important de se rappeler que ces cellules sont seulement responsables de la régénération des muqueuses. D'autres types de cellules telles que les fibroblastes, les neurones, les cellules musculaires lisses et les vaisseaux sanguins sont également tout aussi important pour l'étude des maladies de l'œsophage et pour des applications d'ingénierie tissulaire.
Cette technique offre une source cellulaire spécifique au patient qui est un outil précieux pour l'étude de la pathogenèse de la maladie ainsi que de servir comme un réservoir potentiel de cellules spécifiques au patient pour des applications d'ingénierie tissulaire oesophagiennes. Les cellules utilisées pour l'ensemencement biomatériaux pour implantation chirurgicale doivent être exempts d'anomalies génétiques, des séquences virales et non former des tératomes. L'utilisation de cellules souches multipotentes (ou pluripotentes) génère trop de types cellulaires indésirables suivants différenciation, dont certains peuvent former des tératomes si elles ne sont pas soumis différenciation. Par ailleurs, cette source de phénotype cellulaire est compatible et ne requiert pas la purification ou l'élimination des cellules non désirées. La source de la cellule idéale sera de cellules qui se trouvent dans le même site anatomique qui est conçu. Dans cette approche, ces cellules épithéliales de l'œsophage sont utilisés pour repeupler la muqueuse d'un échafaudage oesophagien. les types de cellules supplémentaires sont nécessaires pour la régénération de l'oesophage; cependant, a fait l'objet de cette technique pour assurer la muqueuse a été réensemencées et non incomplète car cela peut conduire à des fuites, rétrécissements et perforation.
En plus d'utiliser ces cellules pour l'ingénierie de nouvelles options chirurgicales pour l'œsophage, ces cellules peuvent également être utilisés pour étudier les processus de maladies oesophagiennes ainsi que l'écran pour de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter ces conditions. oesophagite à éosinophiles (EOE) est décrit comme une maladie allergique de l'oesophage, avec le mécanisme exact et la pathogenèse pas encore complètement décrit. Current reg de traitementmodes de comprennent les régimes d'élimination, des stéroïdes oraux et plusieurs endoscopies. Aucun test existe pour évaluer ce qui déclenche le processus inflammatoire pour chaque patient, ce qui conduit les médecins à utiliser une «estimation et vérifier« l'approche qui est long et souvent frustrant pour le patient. Étant donné que ce procédé d'expansion cellulaire spécifique au patient n'utilise pas la transduction lentivirale ou une modification génétique, la possibilité de changements permanents dans le génotype des cellules provenant du processus de reprogrammation est minime. Cela signifie que les cellules restent en principe inchangés par rapport à l'environnement in vivo. La capacité à tester les cellules du patient in vitro pour identifier l'agent de déclenchement serait nouveau et pourrait finalement conduire au développement de nouveaux diagnostics ou thérapeutiques pour ces patients pédiatriques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
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