Summary
הרחבת תאי אפיתל ושט ילדים אנושיים ניצול תכנות מחדש מותנה מספקת חוקרים עם אוכלוסיית חולים ספציפיים של תאים שיכולים להיות מנוצלת עבור הנדסת בונת ושט להשתלה אוטולוגית לטיפול פגמים או פציעה ומגיש כמאגר מבחני מיון טיפוליים.
Introduction
הנדסת רקמות בושט דלקת ושט אאוזינופילית (EOE) הייתה במוקד המחקר במעבדות רבות בעשור האחרון. מומים מולדים, כגון atresia ושט, נראים כ 1 ב -4,000 לידה חייה, שתוצאתה הפיתוח השלם של הוושט המוביל את חוסר היכולת לאכול 1. שכיחות ושכיחות EOE היו במגמת עלייה מאז זיהוי של הישות המחלה בשנת 1993. תחולת EOE נע בין 0.7 כדי 10 / 100,000 לנפש שנים והשכיחות נע מ -0.2 כדי 43 / 100,000 2. גישה כירורגית אטרקטיבית חדשה בטיפול atresia ושט פער ארוך מורכבת ביצירת מבני רקמות להשתלת ניצול התא של החולה עצמו. תאים אלה בשיתוף עם פיגומים סינטטיים יפיקו מבנה עצמי שאינו דורש דיכוי מערכת חיסוני. חלק מהקבוצות כבר החלו לחקור את לנודואר של תאים דמויי גזע עבור הנדסת רקמות ושט 3 וכן שימוש בתאי אפיתל ושט יליד לאכלס מחדש את הרירית 4 - 7. מחלות שנמצאים הוושט של מטופלים ילדים הם לעתים קרובות קשה לאבחן או ללמוד ללא התערבות. יתר על כן, מודלים של בעלי חיים תוך ניצול או במבחנה הנציחו מודלי שורת תאים למחל ילדים כמו EOE לא להקיף את בהיווצרות המחלה המדויקת או הבדלים מסוימים חולה 8. לכן, היכולת ללמוד תהליך מחלתו של מטופל במבחנה כדי לזהות אנטיגנים מפעילים מחלה ספציפי, להעריך מנגנונים ולחקור טיפולים תרופתיים יהיה רומן ולספק לרופאים עם מידע שיכול לסייע בטיפול בחולה.
היו הרבה סוגי תאים עצמיים או חולה ספציפי כי הוצעו לשימוש tissuהנדסת דואר ולומד בהיווצרות מחלה אנושית. עם זאת, חלק של סוגי תאים אלו מוגבלים ביכולת שלהם לייצר מספיק תאים של פנוטיפ ספציפי זרע פיגום גדול או לבצע העברת נתונים גבוהות במבחנה. השימוש בתאי גזע פלוריפוטנטיים או מולטיפוטנטיים כבר נושא לדיון מחקר רב, עם זאת, מגבלות וליקויים עבור באמצעות תאים אלה כבר היטיב לתאר 9. השימוש בתאי גזע עובריים אנושיים הוא התווכח מאוד ומציג שאלות אתיות רבות. והחשוב מכל, תאים אלה יוצרים teratomas, דומי גידול, אם הם אינם מובחנים מן פלוריפוטנטיים מדינתם לפני מתן אותם שורת חיים 10. יתר על כן, השימוש בתאי גזע עובריים לא יהיה חולה ספציפי ויכול לעורר תגובה אלוגנאית וצורך דיכוי מערכת חיסוני 10. תאי גזע מושרים (iPSCs) הם תאים פלוריפוטנטיים שיכולהלהיות שמקורם בתאים עצמו חולה. תאים סומטיים, כגון תאי עור, יכולים להיגרם למדינה פלוריפוטנטיים תוך שימוש במגוון של טכניקות אינטגרטיבית בלתי משתלבות. תאים אלה לשמש מקורות תא ספציפי לחולה עבור הנדסת רקמות או חקירת מחלה. השילוב של חומר גנטי לא רצוי לתוך התאים אלה הוא דאגה רבה תארה וגם אם רצפים הם הוסרו לחלוטין iPSCs להופיע לשמר אפיגנטיים "זיכרון" לקראת סוג התא שממנו הם נגזרו 11. תאים אלה גם יהוו teratomas in vivo אם לא הבדיל לפני ההשתלה 11. פרוטוקולי בידול רבים נחקרו התמקדות שושלות אפיתל 12, 13, 14, לעומת זאת, חשוב מאוד לציין כי סוגי התא וכתוצאה מכך בסוף הבידול אינם עשויים מקשה אחת ו- Only להחזיק חלק מן סוג התא של עניין. התוצאה היא תשואה נמוכה והצורך לטהר את סוג התא הרצוי. למרות iPSCs הוא מקור תא חולה ספציפי פוטנציאל, התהליך כדי לקבל סוג תא של עניין עבור הנדסה או רקמות או חקירת מחלה הוא מאוד לא יעיל.
תאי אפיתל אדם בודדו בהצלחת ממגוון הוא לרקמות חולות ולא חולה בגוף האדם כולל: ריאות 15, שד 16, מעי דק 17, מעי גס 18, שלפוחית שתן 19 ו -20 ושט. חשוב לציין כי תאים ראשוניים אדם יש מספר סופי של הקטעים שבהם הפנוטיפ נשמר 21, 22. למרבה הצער, זה אומר כי מספר התאים הדרושים לחקירת מחלה או זריעת פיגום מהונדסלהשתלה לא יכול להיות מושגת. לכן, טכניקות חדשות נדרשות להרחיב תאי מטופל, תוך שמירה על פנוטיפ אפיתל. תכנות מחדש מותנה של תאי אפיתל תקינים ותאי סרטן ניצול מזין תאים ו מעכב ROCK תוארה בשנת 2012 על ידי Liu et al. 2 3. טכניקה זו נוצלה כדי להרחיב לתאי האפיתל סרטניים המתקבלים ביופסיות של סרטן הערמונית וסרטן השד באמצעות תאי מזין מוקרנים, מעכב ROCK ובינוני תכנות מחדש על תנאי. המטרה היתה לייצר תאים מספיק עבור מבחני חוץ גופית כגון הקרנת סמים. טכניקה זו מסוגלת הרחבת תאי אפיתל ללא הגבלת זמן על ידי "תכנות מחדש" של תאים אלה גבעול או המדינה- כמו אבי, שהוא שגשוג מאוד. הוכח כי התאים האלה הם בלתי tumorigenic ואינם בעלי יכולת לגבש teratomas 23, 24. יתר על כן, לאפגמים בכרומוזומים או מניפולציות גנטיות נכחו לאחר passaging תאים אלה בתרבות באמצעות טכניקה זו 23, 24. והחשוב מכל, תאים אלה הם רק מסוגלים להתמיין לסוג תא יליד העניין. לכן, טכניקה זו מציעה מאגר גדול של תאי אפיתל מטופל ספציפי לחקירת מחלה או הנדסת רקמות ללא צורך הנצחה.
קבלת רקמות אפיתל מאיבר מסוים על מנת ללמוד תהליכי מחלה עשויה להיות מצומצמת ולא תמיד אפשרית בשל סיכון מטופל. עבור אותם חולים הסובלים ממחלת ושט או פגמים, תחזור ביופסיה אנדוסקופית היא גישה פולשנית להשגת רקמת אפיתל שניתן ניתקת לתכנות מחדש על התנאי לספק מקור תא מוגדר ספציפי הרירי של אותו הוושט חולה. אז זה מאפשר ללימודי חוץ גופיתשל תאי אפיתל להעריך תהליכי מחלה ומסך עבור הרפוי פוטנציאלי. תהליך המחלה אחד שיכול להפיק תועלת רבה מן גישה זו היא דלקת ושט אאוזינופילית, אשר תוארה מחלות אלרגיות של הוושט 8. בדיקות אלרגיה כמו גם גישות טיפוליות ניתן היה להעריך במבחנה תוך שימוש בתאי האפיתל של החולה עצמו ונתונים אלה לאחר מכן ניתן עברו על הרופא המטפל לפתח תוכניות טיפול אישיות. הטכניקה של תכנות מחדש מותנה בשיתוף עם קבלת ביופסיות אנדוסקופיות מחולי ילדים מציעה את היכולת להרחיב את תאי אפיתל ושט נורמלים ללא הגבלה זמן מכל חולה. מקור תא זה יכול אפוא להיות חבריו בפיגום טבעי או סינטטי לספק אפשרות כירורגית מטופל ספציפי עבור פגמים, מחלה או טראומה. לאחר מספר תאים בלתי מוגדר יעזור להנדס בונת ושט המשתלטת על reseeded לחלוטיןלומן עם תאי אפיתל הוושט כדי לעזור להקל על התחדשות של תאים מסוגים הנותרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ביופסיות ושט התקבלו לאחר הסכמה מהדעת התקבלה ההורים / אפוטרופוסים של מטופלי ילדים ובהתאם לוח הסקירה מוסדי (IRB # 13-094).
פתרון 1. מכשירי חיטוי לטין
- מלקחי חיטוי, סכיני גילוח ומספרי לפני טיפול רקמות על מנת למנוע זיהום.
- כדי להפוך 200 מ"ל של תמיסת הג'לטין 0.1%, לשלב 200 מ"ל מים מזוקקים עם 0.2 גרם של ג'לטין. חיטוי וקריר לפני שימוש.
2. תרבות צלחות רקמות ציפוי
- כ 2 שעות לפני בידוד תא, להוסיף מספיק 0.1% ג'לטין לכסות צלחת בתרבית רקמה (100 מ"מ) ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס חממה תרבית תאים.
הערה: אלה צלחות יכולות גם להתבצע מראש והמשיכו בחממה לפני השימוש.
3. ביצוע פתרון אנזימים עבור דיסוציאציה
- כ -30 דקות לפני בידוד תא, לשקול את10 יחידות של dispase על איזון על בסיס יחידות לכל ריכוז מיליגרם על הבקבוקון. מניחים את אבקת צינור חרוטי 15 מ"ל עם 10 מ"ל של מדיום הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) ומניחים באמבט מים C ° 37.
4. Cell ביצוע בינוני תרבות
- כדי להפוך 50 מ"ל של מדיום תכנות מחדש מותנה, לערבב את החומרים הבאים לתוך צינור חרוטי סטרילי: 35 מ"ל של F12 (בינוני של Ham), 11.5 מ"ל של DMEM, 0.5 מ"ל של L- גלוטמין, 0.5 מ"ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין, 2.5 מ"ל של בסרום שור העובר (FBS), 250 מיקרוגרם של אינסולין אנושי, 500 ננוגרם של גורם הגדילה באפידרמיס האדם (EGF).
- כדי להפוך 500 מ"ל של 3T3 בינוני, לערבב 50 מ"ל של FBS, 5 מ"ל של 100x פניצילין / סטרפטומיצין ו 5 מ"ל של L- גלוטמין עם 500 מ"ל של DMEM.
- כדי להפוך 500 מ"ל של מדיום סרום ללא keratinocyte, להפשיר EGF ותמצית יותרת המוח שור (BPE) תוספי מזון (מסופק עם התקשורת). מוסיפים את ונספחי בקבוק מ"ל 500 של המדיום בסיס ולהוסיף 5 מ"ל של 10פניצילין 0x / סטרפטומיצין
5. Culturing ו irradiating 3T3 תאים כמקור מזין
- הכן בינוני 3T3, המהווים DMEM, 10% FBS, 1x פניצילין / סטרפטומיצין ו -2 מ"מ L- גלוטמין.
- תרבות 3T3 תאי צלוחיות רקמות שטופלו T-75 לפחות 3 ימים לפני ההגעה של דגימות חולות.
- זמן קצר לפני הגעתו של דגימות חולות, trypsinize 3T3 תאים באמצעות 5 מיליליטר של 0.25% טריפסין- EDTA לכל בקבוק לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות או עד שרוב התאים צפו
- הוסף 5 מ"ל של 3T3 בינוני כדי לעצור את התגובה. לשאוב את ההשעיה תא ולהעביר צינור חרוטי 15 מ"ל. ספין במשך 5 דקות ב g 300 x.
- לשאוב הבינוני resuspend תאים בנפח מוגדר של כחול Trypan עבור ספירת תאים. שלב 10 μL של תאים עם 10 μL של Trypan כחול להוציא תאים מתים. טען 10 μL של פתרון זה על hemocytometer עבור ספירת תאים.
הערה: לקבלת פרוטו זהcol, צפיפות זריעה עבור 3T3 תאים מוקרן הוא 10,900 תאים לס"מ 2, אשר שווה 600,000 תאים לכל צלחת 100 מ"מ. - Aliquot את מספר התאים הדרושים צלחת צלחת 100 מ"מ לדגימה המטופל resuspend ב 25 מ"ל של 3T3 בינוניים צינור חרוטי 50 מ"ל ו מקרינים עם 3000 rads.
- בעקבות הקרנה, ספין התאים למשך 5 דקות ב 300 XG ו resuspend במדיום תכנות מחדש מותנה ב 5 מ"ל לכל 100 צלחת מ"מ.
- הגדר את צינור הצידה עד הציפוי של תאי חולה מתרחש מאוחר יותר בפרוטוקול (ראה שלב 7.6).
6. קבלה, שימור הובלת ביופסיות Pediatric ושט
- הוסף 5 מ"ל של סרום ללא בינוני keratinocyte להשלים עם 100 מיקרוגרם / מ"ל primocin עד 15 צינורות חרוטי מ"ל ולהביא אותו למוקד רפואי על הקרח.
הערה: אלה צינורות של המדיום יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס עד 2 חודשים. - השג כ 8 ביופסיות הוושט בבית tiלי אנדוסקופיה ונפרד כדלקמן:
- מניחים שש ביופסיות של חרוטי 15 מ"ל המכיל בינוני חופשי בסרום keratinocyte להשלים עם 100 מיקרוגרם / מ"ל primocin ומניחים על קרח רטוב.
- מניח ביופסיה אחד ב 5 מיליליטר של פורמלין שנאגר ומניחים על קרח רטוב.
- מניח ביופסיה אחת ביופסיה קטנה cryomold עם מתחם טמפרטורת חיתוך אופטימלי.
- מיד טיפה עובש זה לתוך מבחנה של איזופנטאן להציב בחנקן נוזלי. לאחר קפוא, למקם את cryomold בשקית הדגימה ולאחסן על קרח יבש במיכל קצף פוליסטירן.
- מניחים את צינורות המכילים ביופסיות במדיום או פורמלין בתוך שקית סגר ולאחר מכן לתוך קופסת משלוח המכיל קרח רטוב. חותם תווית בתיבה עם תווית Biohazard ולהעביר אותה למעבדה.
הערה: המכל המכיל את הקרח היבש הביופסיה קפוא הוא חתום גם ומסומן עם תווית Biohazard.
עיבוד 7.רקמות חולות לתרבות ניתוח Downstream
- בהגיעם במעבדה, להעביר הביופסיה קפוא על קרח יבש כדי מקפיא -80 מעלות צלזיוס למשך חתך במורד הזרם או מיצוי RNA. מניחים את המדגם בפורמלין. אחסן במקרר 4 ° C ולאפשר לתקן לילה.
- ספין הביופסיות הנותרים למטה ב 300 XG, לשאוב את המדיום. הוסף 10 מיליליטר של dispase פתרון הצינור, חותם חרוטים ולאפשר לו לדגור על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים במשך 15 דקות.
- לאחר הדגירה, לסובב את הביופסיות ב g 300 x. לשאוב ביופסיות בינוני ו resuspend ב 5 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA.
- מעבירים את 5 מ"ל של-EDTA טריפסין המכיל הביופסיות לצלחת 100 מ"מ סטרילית לרכך את ביופסיות באמצעות 2 סכיני גילוח מעוקרים כמו קנס ככל האפשר.
- מעבירים את 5 מ"ל של-EDTA טריפסין המכיל ביופסיות טחון חרוטי 15 מ"ל חדש. יש לשטוף את הצלחת פעמים עם 5 מיליליטר נוסף של 0.05% טריפסין- EDTA ומוסיף החרוטיםצינור. דגירה הצינור במשך 10 דקות באמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
- לאחר הדגירה, לסובב את הביופסיות למטה XG ב 300 (1.4 סל"ד) במשך 5 דקות ו לשאוב את המדיום. הוסף 5 מ"ל של מדיום תכנות מחדש מותנה צינור חרוטי וכן 5 מ"ל של מדיום תכנות מחדש מותנה המכיל את התאים מזין מוקרן (ראה שלב 5.7).
- הוסף מעכב ROCK (1 μL / מ"ל) אל 10 מ"ל של השעיה תא צלחת לאחר aspirating את הג'לטין מצלחת בתרבית רקמה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס.
Culturing 8. תאי הרחבה
- לאחר כ 5 ימים של תרבות, לשאוב את המדיום הראשוני המכיל את חתיכות טחון-ביופסיה ולשטוף את צלחת 2-3 פעמים עם 5 מ"ל PBS סטרילית. הוסף בינוני חדש לצלחת כולל מעכבי ROCK ב 10 מיקרומטר.
- בהגיעם 70% confluency, להרחיב את התאים. הוסף 5 מ"ל של 0.05% טריפסין- EDTA לצלחת דגירה של 37 מעלות צלזיוס חממה לא יותר מ -2.5 דקות כדי להסיר התאי מזין דואר. לאחר דגירה כי, לשאוב טריפסין-EDTA ולשטוף את צלחת עם 5 מ"ל של PBS.
- לשאוב PBS ולהוסיף 5 מ"ל של 0.25% טריפסין- EDTA לצלחת דגירה במשך 5-10 דקות או עד שהתאים רופפים מהצלחת. להוסיף כמויות שווות של מדיום לצלחת כדי לעצור את התגובה ולהעביר את כל הנוזל לצינור 50 מיליליטר חרוטים והמסובב ב XG 300 במשך 5 דקות.
- תאים Resuspend בנפח מוגדר בינוני תכנות מחדש מותנה ומערבבים 10 μL של ההשעיה עם 10 μL של trypan כחול. סמוך על hemocytometer לקבוע מספר תא הכולל.
- כדי להרחיב את התאים, להוסיף 1 מיליון תאים אנושיים הוושט לצלחת 150 מ"מ יחד עם 1.2 מיליון מוקרן 3T3 תאים בנפח כולל של 15 מ"ל. הוסף מעכב ROCK הטרי 10μM ולהוסיף את השעית התא בצלחת ג'לטין צופה 150 מ"מ.
9. להקפיא חנות אדם תאי הוושט אפיתל
- כדי להפוך הקפאה בינונית, מוסיף 10%DMSO עד בינוני תכנות מחדש על תנאי. לאחר trypsinizing ועוד היד נטויה, aliquot התאים להקפיא לתוך צינור 50 מ"ל חרוטי חדש ומסובב ב XG 300 במשך 5 דקות.
- לשאוב הבינוני ומוסיף הקפאה בינונית בהיקף של 2 מיליליטר לכל cryovial. לאחר ההשעיה התא הוא הומוגני, aliquot 10 6 תאים cyrovials מראש שכותרתו. מקום במיכל הקפאה ב -80 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות לפני הזזת צלוחיות אחסון חנקן נוזלי לטווח ארוך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סיכום של צעדי מפתח לבודד תאי אפיתל ושט ביופסיות חולה מסוכם באיור 1. מושבות של תאי אפיתל תהווינה כ 4-5 ימים ויהיו מוקפות תאי מזין פיברובלסטים (איור 2 א). כמו מושבות אלה להרחיב הם יתמזגו עם מושבות אחרות כדי ליצור מושבות גדולות יותר (איור 2 ב). לאחר התרבויות הפכו 70% ומחוברות, הם צריכים להיות מורחבים (איור 2 ג). כדי להבטיח כי פיברובלסטים יוסרו מהצלחת לפני הסרת תאי אפיתל, 0.05% טריפסין-EDTA משמש עד 2.5 דקות כדי להסיר את כלי האוכל. היעדר מתקני האכלה צריך להיראות דומה איור 2 ד. לתאי האפיתל החסידים אז הם trypsinized עם 0.25% טריפסין- EDTA ו replated על תאי מזין מוקרן חדשים (2E איור).
אפיון דק page = "1"> פנוטיפי של תאים אלה באמצעות qRT-PCR מדגים גברת ביטוי של p63, סמן של ובתאים בסוף המעבר 1, תוך שמירת E-cadherin וביטוי TJP1 לעומת מדגם הביופסיה הראשוני . זה מצביע על כך תאים כבר "לתכנת מחדש" למצב אב / גזע דמוי יותר כי הם יותר שגשוג לעומת תאים שאינם לתכנות מחדש. כאשר תאים אלה לקוחי תנאי תכנות מחדש המותנים ו מצופים על צלחות תרבות נורמליות רקמות, הביטוי של ירידות p63 ו TJP1 ו- E-cadherin (CDH1) מגביר הוכחת שינוי פנוטיפ מתא אב לתא אפיתל בדיל יותר (איור 3 א ). התאים הללו נותחו גם מעבר 1 עבור סמנים האפיתל באמצעות cytometry הזרימה גדול מ -90% של התאים הנמצאים משלושה חולים היו חיוביים עבור EpCAM (איור 3 ב). תאים נותחו גם באמצעות immunofluorescence ב קטעים 1 ו -3 כדי להבטיח את הפנוטיפ מעל 3 קטעים אלה לא משתנים. מכתים מדגים את ההתמדה של E-cadherin סמן אפיתל (איור 4 א-ד), p63 סמן אב (איור 4E-H), סמן התפשטות KI-67 (איור 4I-L) TJP1 חלבון צומת הדוק אפיתל (איור 4M-P ).
לבסוף, עקומת הצמיחה היה להתוות באמצעות שורת תאים מחולה שאינו חולה כדי להעריך את זמן ההכפלה של תאים אלה בתרבות תכנות מחדש על תנאי. התאים היו מצופה ב 100,000 תאים ביום 0 ונמצאו להיות רק מעט מעל 500,000 תאים ביום 4 (איור 5). שעת ההכפלה חושבה להיות כ 36-40 שעות. צפוי כי תאים חולים יצטרכו זמן הכפלה איטי, לעומת זאת, כל חולה יש להעריך בנפרד לתת דין וחשבון על הבדלים אישיים.
1 ">
איור 1: סקירה כללית של בידוד Culturing אדם הוושט אפיתל תאי ביופסיות Pediatric. ביופסיות מתקבלים מטופלים ילדים לאחר הסכמה מדעת והובל במדיום סרום ללא keratinocyte למעבדה. ביופסיות אלה מטופלים מכן עם 1 U / mL של dispase, ואחריו וקוצצים את הרקמה עם סכיני גילוח סטרילי ולבסוף בטיפול עם 0.05% טריפסין- EDTA. השעית התא מתווספת לאחר מכן תאי מזין מוקרנים במדיום תכנות מחדש על תנאי. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: Culturing והרחבת אדם הוושט אפיתל תאים. לאחר 5 ימים לתכנת מחדש מותנהבינוני מינג, תאי אפיתל ושט מתחילים להיוצר מושבות מרוצפות קטנות (א), אשר בסופו של דבר להתכנס ליצור מושבות גדולות (B). לאחר הצליח בתרבית הרקמה מגיע 70 מפגש% (C), הצלחות שטופלו למשך זמן קצר מאוד עם 0.05% טריפסין- EDTA כדי להסיר את התאים המזינים, תוך שמירה על הדבקות של תאי אפיתל (D). לתאים האפיתל מכן יוסרו עם 0.25% טריפסין- EDTA ו replated עם תאי מזין חדשים. רק 24 h אחרי פיצול תאים אלה הם יהוו מושבות חדשות ממשיכים להתרבות (E). גדלה היא 100X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: Cytometry זרימה qRT-Pניתוח CR של תאים מורחבים בתרבות. (א) ביטוי גנים נציג של התאים בתרבית ב מעבר 1 של תכנות מחדש מותנה הציג עלייה 6 קפל ביטוי p63, סמן של ובתאים וכן ירידה סמנים אפיתל CDH1 ו TJP1 לעומת ביטוי גנים ביופסיה. זה מצביע על אוכלוסיית התא נמצאת במצב יותר ובתאים דמויים ולכן הוא יותר גבוה שגשוג. התבטאות גנים 24 שעות לאחר תכנות מחדש (לאחר הסרת תאי מזין ורוק מונע) מדגים גדל ביטוי CDH1 ו TJP1 אך ירידת ביטוי p63. (ב) Cytometry זרימה ניתוח של תאים מחולים מרובים להשיג בחנות מעבר 1 להפגין יותר מ -90% של התאים המבטאים EpCAM. חולה 27 מייצג תאי חולה הלא EOE, בעוד חולי 26 ו -28 הם תאי חולה EOE. אנא לחץ כאן to לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: Immunofluorescence צביעת תאים ב מעברי 1 ו -3 תאים שגודלו במדיום תכנות מחדש מותנה עם תאי מזין מוקרנים המפורש E-cadherin (A - D) וכן p63 סמן אב (E - H). תאים אלה הם עדיין שגשוג ב מעבר 3 (אני - L). לבסוף, תאים אלה מבטאים צומת חזק חלבון 1 (TJP1), אשר עולה בקנה אחד גם עם פנוטיפ אפיתל (M - P). גרעינים counterstained עם DAPI (כחול) ונוגדנים מזוהים באמצעות נוגדן אלקסה פלואוריד 546 (אורנג '). 2 nd נוגדן (AB) שליטה מייצג את הלא ספציפית מחייב של נוגדנים משני לרקמה (Q, R). ברי סולם = 50מיקרומטר. גדלה היא 200X. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: עקומת הצמיחה של תאים Reprogramming מותנה. תאים במדיום תכנות מחדש מותנה מחולה שאינה חולה היו זורעים בצפיפות מוגדרת משכפל של שלוש נספרו בכל יום במשך 4 ימים. עקומת הצמיחה נוצרה באמצעות ספירת תאים אלה זמן ההכפלה חושב על בסיס המספרים המתקבל יום 4 ויום 0. שעת ההכפלה של תאים אלה הוא כ 36-40 שעות. ברי שגיאה מצביעים סטיית התקן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הצעדים החשובים ביותר על מנת לבודד להרחיב בתאי אפיתל הוושט ביופסיות המטופל הם: 1) כראוי מתנער הדגימה יחד מוות של תאים מינימלי; 2) להבטיח מעכב ROCK מתווסף בינוני תרבית תאים בכל החלפה בינונית; 3) אין להשתמש תאים מזינים יותר ממומלץ; 4) לשמור על תרבות מזוהמת נקיה; ו -5) תאים מעבר רק לפני שהגיע מפגש.
בשל ההבדלים הקשורים למטופל בדגימות ביופסיה השיגו לתכנות מחדש מותנה, סביר לצפות הבדלי קינטיקה צמיחה, פנוטיפ ויכל להתרחב קטעים מרובים. בדרך כלל, 4 ביופסיות ושט מתקבלות כל מטופל ומטופל בידוד תא. לאחר ניתק, אנחנו נטינו כ 300,000-600,000 תאים ביום 0. זה מתרחב ל מעל 10 מיליון תאים על ידי מעבר 3 בממוצע. מורפולוגיה של מושבות היוצרות אמורות להיות דומה מורפולוגיה מרוצפת תארה עבור שורות תאי אפיתל <sup class = "Xref"> 25 (איור 2). מדגם של תאים בתרבית יש לנתח באמצעות qRT-PCR, cytometry זרימה ו immunofluorescence עבור סמנים האפיתל על מנת להבטיח לאוכלוסיות ההרחבה אכן אפיתל במקורו (איור 3). האם התאים אינם מבטאים סמנים אפיתל (E-cadherin, EpCAM, TJP1), קו התא צריך להסתיים וזנוח. צפוי כי יותר מ -90% של התאים הנמצאים הם EpCAM חיובי אם הם אפיתל במקורם. על מנת להעריך אם התרבויות משתנות פנוטיפ או לאבד ביטוי, immunofluorescence אפיתל או cytometry הזרימה צריך להיות מנוצל כדי להעריך סמני אפיתל (E-cadherin), ביטוי אב (p63), וחלבוני צומת הדוקים אפיתל (TJP1). כאשר התאים הם passaged צפוי כי הפנוטיפ לא צריך לשנות, שגשוג לא צריך ירידת תאים אלה צריכים להציג ביטוי אפיתל כמו גם ביטוי אב (איור 4 (איור 5). תאים הנמצאים לא להכפיל במשך יותר מ 5 ימים צפויים להיות מזדקנים אמורים להיות מושלכים.
היא תוארה כי תאים מבודדים מחולים עם תהליכים דלקתיים נוכחיים, כגון EOE, להחזיק לתאי האפיתל שיש להם שיעור שגשוג ירד, ירד ביטוי E-cadherin (איור 3, חולי 26 ו -28) לבין שיעור גבוה של אפופטוזיס 26. לכן, אין זה בלתי סביר שיהיו תאי culturing קושי מחולה במחלה קשה בשיטה זו. יתכן כי תאים יעמדו רק כמה קטעים או אפילו רק מעבר ראשוני. זה עדיין צריך לספק את החוקר עם מספר גדול יותר של תאים מאשר במקור מבודד. עם זאת, מספר זה לא יכול להיות הולםעבור כל המחקרים המוצעים. מאז תאים אלה נמצאים בשימוש בסופו של דבר ללמוד מחלת ושט או לבנות תחליף ושט, חשוב לזכור תאים אלה אחראים רק על התחדשות רירית. סוגי תאים אחרים, כגון פיברובלסטים, תאי עצב, תאי שריר חלק וכלי דם הם גם לא פחות חשובים בחקר מחלות בושט ועבור יישומי הנדסת רקמות.
טכניקה זו מציעה מקור תא ספציפי לחולה כי הוא כלי רב ערך ללימוד בהיווצרות מחלה כמו גם משרת כמאגר פוטנציאלי של תאי מטופל ספציפי עבור יישומי הנדסת רקמות ושט. התאים מנוצלים עבור זריעת biomaterials להשתלה כירורגית חייבים להיות חופשיים של מומים גנטיים, רצפים ויראלי ולא יוצרים teratomas. השימוש בתאי גזע (multipotent פלוריפוטנטים) מייצר יותר מדי סוגי תאים לא רצויים הבאים בידול, שחלקם יכולים להיווצר teratomas אם הם לא עברו בידולtiation. יתר על כן, פנוטיפ מקור התא זו עולה בקנה אחד ואינו דורש טיהור או הסרה של תאים לא רצויים. המקור הנייד האידיאלי יהיה תאים המצויים באותו המיקום אנטומי כי מתבצע מהונדס. בגישה זו תאי אפיתל ושט אלה נמצאים בשימוש כדי לאכלס מחדש את הרירית של פיגום ושט. סוגי תאים נוספים נדרשים להתחדשות ושט; עם זאת, ההתמקדות של טכניקה זו באה להבטיח את הרירית הייתה reseeded ולא שלמה כמו זה יכול להוביל לדליפה, היצרות ו ניקוב.
בנוסף לשימוש בתאים אלה להנדסה אפשרויות כירורגיות חדשות הוושט, תאים אלה יכולים לשמש גם כדי ללמוד תהליכי מחלה הוושט וכן מסך עבור גישות טיפוליות חדשות לטיפול במצבים אלה. דלקת ושט אאוזינופילית (EOE) מתוארת כמחלה אלרגית של הוושט, עם מנגנון בפתוגנזה המדויק טרם תיאר באופן מלא. reg טיפול נוכחיiments כולל דיאטות אלימינציה, סטרואידים דרך פה ו endoscopies המרובה. אין assay קיים להעריך מה מעורר את התהליך הדלקתי לכל מטופל, אשר מוביל רופאים להשתמש "ניחוש ולבדוק" גישה שהוא ארוך לעתים מתסכל עבור המטופל. מאז שיטה זו של הרחבת תא חולה ספציפית לא לנצל תמרת lentiviral או הנדסה גנטית, את האפשרות של שינויים קבועים הגנוטיפ של התאים מתהליך תכנות מחדש היא מינימאלית. משמעות הדבר התאים באופן תיאורטי להישאר ללא שינוי מהסביבה vivo. היכולת לבדוק תאים חולים במבחנת לזהות הסוכן המפעיל יהיה רומן ובסופו של דבר יכולה להוביל להתפתחות של ואבחנות או רפוי עבור מטופלי ילדים אלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
