Summary
Expansão de células epiteliais humanas esofágicas pediátricos utilizando reprogramação condicional fornece investigadores com uma população específica no paciente de células que pode ser utilizada para engenharia construções esofágicas autólogo para implantação para tratar defeitos ou ferimentos e servir como um reservatório para ensaios de pesquisa de terapêuticos.
Introduction
engenharia de tecidos e esofagite eosinofílica (EoE) têm sido o foco de pesquisas em muitos laboratórios ao longo da última década. Defeitos congênitos, como a atresia de esôfago, são vistos em aproximadamente 1 em cada 4.000 nascidos vivos, o que resulta no desenvolvimento incompleto do esôfago levando à incapacidade de comer 1. A incidência e prevalência de EoE têm vindo a aumentar desde a identificação da entidade doença em 1993. A incidência de EoE variou entre 0,7 a 10 / 100.000 por pessoa-ano e a prevalência variou de 0,2-43 / 100.000 2. Uma nova abordagem cirúrgica atraente para o tratamento de longo intervalo atresia esofágica consiste na geração de construções de tecido para implante utilizando as células do próprio paciente. Estas células em conjunto com o andaime sintético irá gerar um construto autólogo que não exige imunossupressão. Alguns grupos já começaram a investigar os EUAe de células estaminais, como para engenharia de tecido esofágico 3, bem como a utilização de células epiteliais esofágicas nativas para repovoar a mucosa 4-7. Doenças que estão presentes no esófago do paciente pediátrico são muitas vezes difíceis de diagnosticar ou estudar sem intervenção. Além disso, utilizando modelos animais ou in vitro imortalizado modelos da linha celular para doenças pediátricas como EoE não abranger a patogênese da doença exata ou diferenças específicas dos pacientes 8. Portanto, a capacidade para o estudo do processo de doença de um paciente in vitro, a fim de identificar antigénios específicos de doença desencadeamento, avaliar os mecanismos subjacentes e investigar tratamentos com drogas seria novo e proporcionar aos médicos com informações que podem ajudar no tratamento do paciente.
Tem havido muitos tipos de células autólogas ou específicas do paciente que têm sido propostas para utilização em tissue engenharia e estudando patogênese da doença humana. No entanto, alguns destes tipos de células são limitados na sua capacidade para gerar células suficientes de um fenótipo específico para semear um grande andaime ou executar alto rendimento em estudos in vitro. O uso de células-tronco pluripotentes ou multipotentes tem sido o tema de muita discussão pesquisa, no entanto, limitações e insuficiências para o uso dessas células têm sido bem descrito 9. A utilização de células estaminais embrionárias humanas é altamente debatido e apresenta muitas questões éticas. Mais importante, estas células formam teratomas, que são semelhantes a um tumor, se eles não são diferenciados a partir de seu estado pluripotentes antes de entregar os em um hospedeiro vivo 10. Além disso, a utilização de células estaminais embrionárias não seria-específico do paciente e pode desencadear uma resposta alogénica e a necessidade para a supressão imune 10. Induzidas células-tronco pluripotentes (iPSCs) são células pluripotentes que podemser derivado a partir de células do próprio paciente. As células somáticas, tais como as células da pele, pode ser induzido para um estado pluripotente usando uma variedade de técnicas de integração e não-integrativos. Essas células, então, servir como uma fonte de células específicas do paciente para engenharia de tecidos ou de investigação da doença. A integração de material genético indesejado para estas células é uma preocupação muitos descreveram e mesmo sequências são completamente removidos iPSCs aparecem para conservar uma "memória" epigenética para o tipo de célula a partir da qual eles foram derivados 11. Estas células também irá formar teratomas in vivo, se não diferenciadas antes do transplante 11. Muitos protocolos de diferenciação têm sido investigados concentrando-se em linhagens epiteliais 12, 13, 14, no entanto, é muito importante notar que os tipos de células que resultam no final de diferenciação não são homogéneos e óomente possuir uma fracção do tipo de células de interesse. Isto resulta em baixo rendimento e a necessidade de purificar o tipo de célula desejado. Embora iPSCs são uma potencial fonte de células específicas do paciente, o processo para obter um tipo de células de interesse, quer para a engenharia de tecidos ou de investigação da doença é muito ineficiente.
Células epiteliais humanas foram isolados com sucesso a partir de uma variedade de ambos os tecidos doentes e não doentes no corpo humano, incluindo: 15 pulmão, de mama 16, 17 intestino delgado, cólon 18, 19 da bexiga e do esófago 20. É importante notar que as células humanas primárias têm um número finito de passagens em que o fenótipo é mantida 21, 22. Infelizmente, isto significa que o número de células necessário para a investigação da doença ou para semear um andaime engenhariapara o implante não pode ser alcançado. Portanto, as novas técnicas são necessários para expandir células do paciente enquanto ainda mantém um fenótipo epitelial. Reprogramação condicional de células epiteliais normais e cancerosos utilizando células alimentadoras e inibidor ROCHA foi descrito em 2012 por Liu et al. 2 3. Esta técnica foi utilizada para expandir células epiteliais cancerosas obtidos a partir de biópsias de câncer de próstata e de mama, utilizando células de alimentação irradiadas, inibidor ROCHA e médias reprogramação condicional. O objetivo era gerar células suficientes para ensaios in vitro, como o rastreio de drogas. Esta técnica é capaz de se expandir células epiteliais indefinidamente por "reprogramar" as células para um tronco ou progenitoras estado semelhante, que é altamente proliferativo. Foi demonstrado que estas células são não-tumorigénico e não possuem a capacidade para formar teratomas 23, 24. Além disso, nenhumanomalias cromossómicas ou manipulações genéticas estavam presentes após passaging estas células em cultura usando esta técnica 23, 24. Mais importante ainda, essas células só são capazes de se diferenciar em células do tipo nativo de interesse. Portanto, esta técnica oferece um grande reservatório de células epiteliais específicos do paciente para investigação da doença ou engenharia de tecidos sem a necessidade de imortalização.
A obtenção de tecido epitelial de um órgão específico, a fim de estudar processos de doença é muitas vezes limitada e nem sempre é possível, devido ao risco de paciente. Para os pacientes que sofrem de doença ou defeitos esofágico, recuperação endoscópica biópsia é uma abordagem minimamente invasiva para a obtenção de tecido epitelial que podem ser dissociados e condicionalmente reprogramadas de modo a proporcionar uma fonte de células indefinida que é específico para a mucosa do esófago que do paciente. Isso, então, permite estudos in vitrodas células epiteliais para avaliar os processos de doença e tela para potenciais agentes terapêuticos. Um processo de doença que poderiam beneficiar grandemente de esta abordagem é esofagite eosinofílica, que tem sido descrita como doença alérgica do esófago 8. Testes de alergia, bem como abordagens terapêuticas poderiam ser avaliada in vitro utilizando as próprias células epiteliais do paciente e estes dados podem então ser transmitida para o médico assistente para desenvolver planos de tratamento individualizado. A técnica de reprogramação condicional em conjunto com a obtenção de biópsias endoscópicas de pacientes pediátricos oferece a capacidade de expandir as células epiteliais do esôfago normais por tempo indeterminado a partir de qualquer paciente. Esta fonte de células poderiam, portanto, ser agrupado em conjunto com andaimes natural ou sintética para fornecer uma opção cirúrgica específica para cada paciente por defeitos, doença ou trauma. Ter um número de celular por tempo indeterminado ajudaria engenharia construções de esôfago que possuem uma completamente reseededlúmen com células epiteliais esofágicas, a fim de ajudar a facilitar a regeneração dos tipos de células restantes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
biópsias esofágicas foram obtidos após consentimento informado foi obtido dos pais / responsáveis dos pacientes pediátricos e de acordo com a placa de revisão institucional (IRB # 13-094).
1. esterilização de instrumentos e gelatina Solution
- forceps autoclave, lâminas de barbear e tesouras antes de manusear do tecido para evitar a contaminação.
- Para fazer 200 ml de solução de gelatina a 0,1%, combinar 200 mL de água destilada com 0,2 g de gelatina. Autoclave e fresco antes da utilização.
2. revestindo placas de cultura de tecidos
- Aproximadamente 2 h antes do isolamento das células, suficiente adicionar 0,1% de gelatina, para cobrir uma placa de cultura de tecido (100 mm) e incuba-se a 37 ° C numa incubadora de cultura de células.
NOTA: Estas placas também pode ser feita antes do tempo e mantido na incubadora antes de utilização.
3. Fazer Solução de Enzima para a dissociação
- Aproximadamente 30 minutos antes do isolamento de células, pesar10 unidades de dispase em um equilíbrio com base nas unidades por miligrama concentração no frasco. Colocar o pó num tubo cónico de 15 mL com 10 mL de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) e colocar num banho de água a 37 ° C.
4. Fazer celular Meio de Cultura
- Para fazer com que 50 ml de meio de reprogramação condicional, misturar os seguintes ingredientes em um tubo estéril cónico: 35 ml de F12 (Meio de Ham), 11,5 mL de DMEM, 0,5 mL de L-glutamina, 0,5 ml de 100 x penicilina / estreptomicina, 2,5 mL de soro fetal de bovino (FBS), 250 ug de insulina humana, 500 ng de factor de crescimento epidérmico humano (EGF).
- Para tornar a 500 mL de meio de 3T3, misturar 50 mL de FBS, 5 mL de 100 x penicilina / estreptomicina e 5 mL de L-glutamina, com 500 mL de meio DMEM.
- Para fazer 500 ml de meio isento de soro queratinócitos, descongelar suplementos extrato de pituitária bovina (BPE) (fornecidos com a mídia) EGF e. Adicionar aos complementos do mL garrafa de meio base 500 e adicionar 5 mL de 100 x penicilina / estreptomicina
5. cultura de células e irradiando 3T3 como fonte Feeder
- Prepare forma 3T3, que compreende DMEM, FBS a 10%, 1x penicilina / estreptomicina e 2 mM de L-glutamina.
- Cultura em células 3T3 tratadas com tecido frascos T-75, pelo menos, 3 dias antes da chegada de amostras de doentes.
- Pouco antes da chegada das amostras dos pacientes, trypsinize 3T3 utilizando 5 mL de 0,25% de tripsina-EDTA por frasco e incubar a 37 ° C durante 5 min ou até que a maioria das células são flutuante
- Adicionar 5 mL de 3T3 meio para parar a reacção. Aspirar a suspensão de células e transferir para um tubo cónico de 15 mL. Rotação durante 5 minutos a 300 x g.
- Aspirar o meio e ressuspender as células em um volume definido de tripano azul para contagem das células. Combinar 10 mL de células com 10 uL de azul Tripano para excluir as células mortas. Carga de 10 uL desta solução em um hemocitómetro para contagem das células.
NOTA: Para este protocol, densidade de sementeira de células irradiadas 3T3 é 10.900 células por cm2, que é igual a 600.000 células por placa de 100 mm. - Alíquota o número de células necessárias para chapear uma placa de 100 mm por amostra do paciente e ressuspender em 25 ml de 3T3 meio num tubo cónico de 50 mL e irradiar com 3000 rads.
- Após a irradiação, as células de spin para baixo por 5 min a 300 x g e ressuspender em meio reprogramação condicional em 5 mL por placa de 100 mm.
- Definir o tubo de lado até que o revestimento de células do paciente ocorre mais tarde no protocolo (ver passo 7.6).
6. Obtenção, Preservar e Transportar pediátricos esofágicas Biópsias
- Adicionar 5 ml de meio isento de soro queratinócitos completo com 100 mcg / mL primocin 15 tubos cônicos ml e trazê-lo para o centro médico no gelo.
NOTA: Estes tubos de meio pode ser armazenado a 4 ° C durante até 2 meses. - Obter aproximadamente 8 biópsias esofágicas na ti-me de endoscopia e separada como segue:
- Coloque seis biópsias no mL cônico de 15 contendo meio sem soro completa de queratinócitos com 100 mcg / mL primocin e colocar no gelo molhado.
- Coloque uma biopsia em 5 ml de formalina tamponada e colocar em gelo molhado.
- Coloque uma biópsia em uma pequena biópsia cryomold com o composto ideal temperatura de corte.
- Imediatamente diminua este molde para uma proveta de isopentano colocado em azoto líquido. Uma vez congelado, o cryomold colocar num saco de amostra e armazenar em gelo seco num recipiente de espuma de poliestireno.
- Coloque os tubos contendo biópsias em médio ou formol dentro de um saco selado e em seguida, em uma caixa de transporte contendo gelo molhado. Selar e rotular a caixa com uma etiqueta de risco biológico e transportá-lo para o laboratório.
NOTA: O recipiente que contém o gelo seco e congelado biópsia também é selado e etiquetado com uma etiqueta de risco biológico.
7. ProcessamentoTecido do paciente para a Cultura e Análise Downstream
- À chegada ao laboratório, transferir a biópsia de congelação em gelo seco a -80 ° C congelador por corte a jusante ou a extração de RNA. Colocar a amostra em formalina. Armazenar em um C geladeira 4 ° e permitir corrigir durante a noite.
- Girar as biópsias restantes para baixo a 300 xg, e aspirar o meio. Adicionar 10 mL de solução de dispase ao tubo cónico, vedação e permitir que a incubar a 37 ° C num banho de água durante 15 min.
- Após a incubação, as biópsias girar para baixo a 300 x g. Aspirar as biópsias médio e ressuspender em 5 mL de 0,05% de tripsina-EDTA.
- Transferir a 5 mL de tripsina-EDTA contendo as biópsias para uma placa de 100 mm e estéril mediu as biópsias utilizando 2 lâminas de barbear esterilizados tão fina quanto possível.
- Transferir a 5 mL de tripsina-EDTA contendo biópsias picadas para um novo 15 mL cónico. Lavar a placa duas vezes com um adicional de 5 mL de 0,05% de tripsina-EDTA e adicionar ao cónicatubo. Incubar o tubo durante 10 minutos num banho de água a 37 ° C.
- Após a incubação, as biópsias girar para baixo a 300 xg (1,4 rpm) durante 5 min e aspirar o meio. Adicionar 5 mL de meio de reprogramação condicional para o tubo cônico, bem como a 5 mL de meio de reprogramação condicional contendo as células de alimentação irradiadas (veja o passo 5.7).
- Adicionar inibidor de rocha (1 mL / mL) ao 10 mL de suspensão de células e aspiração do prato depois de gelatina do prato de cultura de tecidos. Incubar a 37 ° C.
8. A cultura e Células de Expansão
- Depois de aproximadamente 5 dias de cultura, aspirar o médio inicial contendo os pedaços picados por biópsia e lave o prato 2-3 vezes com 5 mL de PBS estéril. Adicionar novo meio para a placa incluindo inibidor ROCHA em 10? M.
- Ao atingir 70% de confluência, expandir as células. Adicionar 5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA para a placa e incubar numa incubadora a 37 ° C não superior a 2,5 min para remover the células alimentadoras. Na sequência desta incubação, aspirar a tripsina-EDTA e lavar a placa com 5 ml de PBS.
- Aspirar o PBS e adicionar 5 mL de 0,25% de tripsina-EDTA para a placa e incubar durante 5-10 minutos ou até que as células estão soltas a partir da placa. Adicionar quantidades iguais de forma que a placa para parar a reacção e transferir todo o fluido para um tubo cónico de 50 mL e girar a 300 xg durante 5 min.
- Ressuspender as células num volume definido de forma condicional reprogramação e misturar 10 ul da suspensão com 10 mL de azul de tripano. Contar com um hemocitômetro para determinar o número total de células.
- Para expandir células, adicionar 1 milhão de células esofágicas humanos para uma placa de 150 mm ao longo com 1,2 milhões de células irradiadas 3T3 num volume total de 15 mL. Adicionar inibidor ROCHA fresco a 10 uM e adicionar a suspensão de células para uma placa revestida de gelatina de 150 mM.
9. As células congelar e armazenar Humano esofágico epiteliais
- Para tornar meio de congelamento, adicionar 10%DMSO a médio reprogramação condicional. Após trypsinizing e contagem, as células alíquota para congelar para um novo tubo de 50 mL cónico e girar a 300 xg durante 5 min.
- Aspirar o meio e adicionar meio de congelação a um volume de 2 ml por frasco de congelação. Uma vez que a suspensão de células é homogéneo, uma alíquota de 10 6 células em cyrovials pré-rotulados. Introduzem-se num recipiente de congelação a -80 ° C durante pelo menos 24 h antes de se mudar os frascos para armazenamento em azoto líquido a longo prazo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Um resumo das principais etapas isolar células epiteliais do esôfago de biópsias de pacientes estão resumidos na Figura 1. As colónias de células epiteliais vai formar em cerca de 4-5 dias e vai ser rodeado por células de alimentação de fibroblastos (Figura 2A). À medida que essas colônias expandir eles vão fundir-se com outras colónias para formar grandes colônias (Figura 2B). Uma vez que as culturas se tornaram 70% confluentes, eles precisam ser expandido (Figura 2C). Para assegurar que os fibroblastos são removidos a partir da placa antes de remover as células epiteliais, 0,05% de tripsina-EDTA é utilizado para até 2,5 min para remover os alimentadores. A ausência de alimentadores deve ser semelhante à Figura 2D. As células epiteliais aderentes são então tripsinizadas com 0,25% de tripsina-EDTA e novamente semeadas em novas células alimentadoras irradiadas (Figura 2E).
(Figura 3A ). Estas células foram também analisadas na passagem 1 por marcadores epiteliais através de citometria de fluxo e mais do que 90% das células presentes a partir de três pacientes foram positivas para EpCAM (Figura 3B). As células também foram analisados por meio de imunofluorescência em passagens 1 e 3 para garantir o fenótipo ao longo desses 3 passagens não estava mudando. A coloração demonstra a persistência de células epiteliais marcador de E-caderina (Figura 4A-D), progenitora marcador P63 (Figura 4E-H), marcador de proliferação de KI-67 (Figura 4I-G) e TJP1 apertado proteína de junção epitelial (Figura 4M-P ).
Por último, uma curva de crescimento foi representada graficamente usando uma linha de células de um paciente não doente para avaliar o tempo de duplicação destas células em cultura de reprogramação condicional. As células foram plaqueadas a 100.000 células no dia 0 e foram encontrados a ser apenas ligeiramente mais de 500000 células no dia 4 (Figura 5). O tempo de duplicação foi calculada como sendo de cerca de 36-40 h. Espera-se que as células doentes terá um tempo de duplicação mais lento, no entanto, todos os pacientes devem ser avaliados separadamente para explicar as diferenças individuais.
1 ">
Figura 1: Visão geral do Isolamento e cultura de células Humano esofágico epiteliais de Pediatria biópsias. Biópsias são obtidos a partir de pacientes pediátricos após consentimento informado e transportados em meio isento de soro de queratinócitos para o laboratório. Essas biópsias são, em seguida, tratada com 1 U / ml de dispase, seguido por trituração do tecido com lâminas de barbear estéreis e, finalmente, tratamento com 0,05% de tripsina-EDTA. A suspensão de células é então adicionado a células de alimentação irradiadas em meio de reprogramação condicional. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A cultura e expandir células humanas epiteliais do esôfago. Após 5 dias de reprogramar condicionalforma Ming, células epiteliais esofágicas começam a formar colónias pequenas de paralelepípedo (A), que, eventualmente convergem para formar colónias maiores (B). Uma vez que o prato de cultura de tecido atinge 70% de confluência (C), as placas são tratados durante um tempo muito breve, com 0,05% de tripsina-EDTA para remover as células de alimentação, enquanto mantém a adesão das células epiteliais (D). As células epiteliais são então removido com 0,25% de tripsina-EDTA e novamente semeadas com novas células alimentadoras. Apenas 24 h após a divisão dessas células irão formar novas colônias e continuam a proliferar (E). Ampliação é 100X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Citometria de fluxo e de qRT-PAnálise CR de células expandidas em cultura. (A) a expressão do gene representativas de células em cultura, a passagem de uma reprogramação condicional demonstraram um aumento de 6 vezes na expressão de P63, um marcador de células progenitoras, bem como uma diminuição nos marcadores epiteliais CDH1 e TJP1, em comparação com a expressão do gene biópsia. Isto indica a população de células está em um estado mais semelhante progenitoras e, por conseguinte, é mais altamente proliferativo. a expressão do gene 24 h pós-reprogramação (após a remoção de células alimentadoras e Rock Inhibitor) demonstra aumento da expressão CDH1 e TJP1 mas uma diminuição na expressão P63. (B) A análise de citometria de fluxo de células de vários pacientes obtidas na passagem 1 demonstram maior do que 90% das células que expressam EpCam. Paciente 27 representa células do paciente não EOE, enquanto os pacientes 26 e 28 são células do paciente EOE. Por favor clique aqui to visualizar uma versão maior desta figura.
Figura 4: Imunofluorescência coloração das células nas passagens 1 e 3. As células cultivadas em meio de reprogramação condicional com células alimentadoras irradiadas expressa a caderina-E (A - D), bem como progenitoras marcador P63 (E - H). Estas células são ainda proliferativa na passagem 3 (I - L). Por fim, estas células expressam proteínas apertado junção 1 (TJP1), que também é consistente com um fenótipo epitelial (M - P). Os núcleos são contrastadas com DAPI (azul) e os anticorpos são detectados usando um anticorpo Alexa Fluor 546 (laranja). 2 nd anticorpo de controlo (Ab) representa a ligação não específica do anticorpo secundário para o tecido (Q, R). Barras de escala = 50uM. Ampliação é 200X. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Curva de crescimento de células na reprogramação condicional. As células em meio de reprogramação condicional a partir de um paciente não doente foram semeadas a uma densidade definida de três repetições e foram contadas todos os dias durante 4 dias. A curva de crescimento foi gerada utilizando estas contagens de células e tempo de duplicação foi calculada com base nos números obtidos no Dia 4 e no Dia 0. O tempo de duplicação destas células é de aproximadamente 36-40 horas. As barras de erro indicam o erro padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Os passos mais importantes, a fim de isolar e expandir células epiteliais esofágicas a partir de biópsias de pacientes são: 1) dissociação adequadamente tecido de biopsia com a morte celular mínima; 2) assegurar ROCHA inibidor é adicionado ao meio de cultura de células em cada mudança de meio; 3) Não use mais células alimentadoras do que o recomendado; 4) manter uma cultura asséptica limpo; e 5) células de passagem apenas antes de atingir a confluência.
Devido às diferenças relacionadas com o paciente em amostras de biópsias obtidas de reprogramação condicional, é razoável esperar que as diferenças na cinética de crescimento, fenótipo e a capacidade de expandir-se para múltiplas passagens. Tipicamente, 4 biópsias esofágicas são obtidos a partir de cada paciente para o isolamento de células. Uma vez dissociada, que renderá cerca de 300,000-600,000 células no dia 0. Isso expande para mais de 10 milhões de células por passagem 3, em média. Morfologia das colónias que formam deve ser semelhante à morfologia de paralelepípedos descrito para linhagens de células epiteliais <sup class = "xref"> 25 (Figura 2). Uma amostra de células em cultura deve ser analisada através de qRT-PCR, e a citometria de fluxo de imunofluorescência para marcadores epiteliais para assegurar as populações de expansão são, de facto epitelial de origem (Figura 3). Se as células não expressam marcadores epiteliais (E-caderina, EpCAM, TJP1), a linha de células deve ser encerrado e descartado. Espera-se que mais de 90% das células estão presentes EpCAM positiva, se eles são de origem epitelial. A fim de avaliar se as culturas estão a mudar ou perder fenótipo epitelial expressão, imunofluorescência ou citometria de fluxo deve ser utilizada para avaliar marcadores epiteliais (E-caderina), expressão de células progenitoras (P63), e proteínas de junções apertadas epiteliais (TJP1). À medida que as células são passadas, espera-se que o fenótipo não deve mudar, não deve diminuir a proliferação destas células e deve exibir expressão epitelial bem como a expressão de células progenitoras (Figura 4 (Figura 5). As células que não são encontrados para dobrar durante mais de 5 dias serão provavelmente senescentes e deve ser descartado.
Tem sido descrito que as células isoladas de doentes com processos inflamatórios presentes, tais como EoE, possuem células epiteliais que possuem uma taxa proliferativa diminuída, a diminuição da expressão de E-caderina (Figura 3, Os pacientes 26 e 28) e uma taxa elevada de apoptose 26. Portanto, não é razoável ter dificuldade cultura de células de um paciente gravemente doente utilizando este método. É possível que as células só vai suportar algumas passagens ou até mesmo a passagem apenas inicial. Isto deve ainda fornecer o investigador com um maior número de células do que o originalmente isolado. No entanto, este número poderá não ser adequadapara todos os estudos propostos. Uma vez que estas células estão sendo usados para, em última análise o estudo das doenças do esôfago ou construir um substituto do esôfago, é importante lembrar que essas células são apenas responsáveis pela regeneração das mucosas. Outros tipos de células, tais como fibroblastos, neurónios, células do músculo liso e vasos sanguíneos também são tão importantes para o estudo da doença esofágico e para aplicações de engenharia de tecidos.
Esta técnica oferece uma fonte de células específicas do paciente, que é uma ferramenta inestimável para estudar patogênese da doença, bem como servir como um reservatório potencial de células específicas do paciente para aplicações de engenharia de tecidos do esôfago. Células utilizadas para semear biomateriais para implantação cirúrgica deve estar livre de anormalidades genéticas, sequências virais e não formar teratomas. A utilização de células estaminais multipotentes (ou pluripotenciais) gera muitos tipos de células indesejáveis seguintes diferenciação, algumas das quais podem formar teratomas se que não foi submetido a diferenciação. Além disso, esta fonte de células fenótipo é coerente e não exige a purificação ou a remoção de células indesejadas. A fonte celular ideal será as células que se encontram no mesmo local anatómico que está a ser manipulada. Nesta abordagem destas células epiteliais esofágicas estão a ser usadas para repovoar a mucosa de um andaime esofágica. tipos celulares adicionais são necessários para a regeneração de esôfago; no entanto, o foco desta técnica era assegurar a mucosa foi reseeded e não incompleta, pois isso pode levar ao vazamento, estenose e perfurações.
Além de utilizar estas células para a engenharia de novas opções cirúrgicas para o esófago, estas células podem também ser utilizados para estudar processos de doença esofágicas, bem como tela para novas abordagens terapêuticas para o tratamento destas condições. esofagite eosinofílica (EOA) é descrita como uma doença alérgica do esófago, com o mecanismo exacto e patogénese ainda não totalmente descritos. Reg tratamento actualiments incluem dietas de eliminação, esteróides orais e várias endoscopias. Não existe ensaio para avaliar o que desencadeia o processo inflamatório para cada paciente, que leva os médicos utilizar um "suposição e vá" abordagem que é muito tempo e muitas vezes frustrante para o paciente. Uma vez que este método de expansão das células específicas do paciente não utiliza transdução lentiviral ou modificação genética, a possibilidade de alterações permanentes para o genótipo das células a partir do processo de reprogramação é mínima. Isto significa que as células permanecem inalterados, teoricamente, a partir do ambiente in vivo. A capacidade de testar células do paciente in vitro para identificar o agente causador seria novo e poderia levar ao desenvolvimento de novos diagnósticos ou terapêuticos para estes pacientes pediátricos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
