Summary
Расширение педиатрических пищеводных эпителиальных клеток человека с использованием условного перепрограммирование обеспечивает исследователей с населением конкретного пациента клеток, которые могут быть использованы для проектирования пищеводные конструкции для аутогенной имплантации для лечения дефектов или травм, и служить в качестве резервуара для терапевтических методов скрининга.
Introduction
инженерия пищеводного ткани и эозинофильный эзофагит (EoE) были в центре внимания исследований во многих лабораториях за последнее десятилетие. Врожденные дефекты, такие как атрезия пищевода, наблюдаются примерно в 1 в 4000 родившихся живыми, что приводит к неполному развитию пищевода , приводящей к невозможности съесть 1. Заболеваемость и распространенность Eoe были на подъеме с тех пор определение сущности болезни в 1993 году заболеваемость Eoe колебалась от 0,7 до 10/100000 на человеко-год , а распространенность колебалась от 0,2 до 43 / 100,000 2. Новый привлекательный хирургический подход к лечению длительного перерыва атрезия пищевода состоит в создании конструкции ткани для имплантации с использованием собственных клеток пациента. Эти клетки в сочетании с синтетическим подмостей произведет аутологичной конструкцию, которая не требует иммуносупрессии. Некоторые группы уже начали исследовать насе стволовых клеток, как для тканевой инженерии пищеводного 3, а также использование местных эпителиальных клеток пищевода заселить слизистую оболочку 4 - 7. Болезни, которые присутствуют в пищевод педиатрических пациентов часто трудно диагностировать или изучать без вмешательства. Кроме того, использование модели на животных или в пробирке увековечены модели клеточной линии для педиатрических заболеваний , как Eoe не охватывают точную патогенез заболевания или пациента специфические различия 8. Таким образом, способность изучать процесс болезни пациента в пробирке с целью выявления конкретных заболеваний вызывая антигены, оценить основные механизмы и исследования лекарственной терапии было бы новым и предоставить врачам информацию , которая может помочь в лечении пациента.
Там было много аутологичных или пациент-специфические типы клеток, которые были предложены для использования в Tissuэлектронной инженерии и изучения патогенеза заболеваний человека. Тем не менее, некоторые из этих типов клеток ограничены в их способности генерировать достаточное количество клеток специфического фенотипа семян большой помост или выполнить высокую пропускную способность в пробирке исследования. Использование плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток была темой многих исследований , обсуждения, однако, ограничения и недостатки использования этих клеток были хорошо описаны 9. Использование человеческих эмбриональных стволовых клеток широко обсуждаемого и представляет множество этических проблем. Самое главное, что эти клетки образуют тератомы, которые похожи на опухоли, если они не отличаются от их плюрипотентных состояния перед подачей их в живом хозяине 10. Кроме того, использование эмбриональных стволовых клеток , не было бы специфическая для пациента и может вызвать реакцию аллогенных и необходимость подавления иммунитета 10. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) являются плюрипотентные клетки, которые могутбыть получены из собственных клеток пациента. Соматические клетки, такие как клетки кожи, могут быть вызваны в плюрипотентное состояние, используя различные интегративные и не интегративные методов. Эти клетки затем служат в качестве пациента специфических клеточных источников для тканевой инженерии или расследования заболеваний. Интеграция нежелательного генетического материала в этих клетках вызывает озабоченность многие из них описаны и даже если последовательности полностью удаляются иПСК появляются , чтобы сохранить эпигенетическую "память" по отношению к типу клеток , из которых они были получены 11. Эти клетки также будут образовывать тератомы в естественных условиях , если не дифференцируются до трансплантации 11. Многие протоколы дифференцировки, сосредоточенные на эпителиальных родословных 12, 13, 14, тем не менее, очень важно отметить , что типы клеток , в результате в конце дифференцировки не однородны и Oолько обладают фракцию типа клеток, представляющих интерес. Это приводит к низкой производительности и необходимость очистить желаемый тип клеток. Хотя иПСК являются потенциальным пациентом конкретный источник клеток, процесс получения типа клеток, представляющих интерес для обеих тканевой инженерии или расследования болезней очень неэффективно.
Человеческие эпителиальные клетки были успешно выделены из различных обоих больных и не пораженных тканей в организме человека в том числе: 15 легких, рака молочной железы 16, тонкой кишки, толстой кишки 17 18, мочевого пузыря 19 и пищевода 20. Важно отметить , что первичные клетки человека имеют конечное число проходов , в которых фенотип поддерживается 21, 22. К сожалению, это означает, что число клеток, необходимых для исследования болезни или для высева сконструированным помостдля имплантации может быть не достигнута. Таким образом, новые технологии необходимы для расширения клетки пациента, сохраняя при этом эпителиального фенотипа. Условный перепрограммирование нормальных и раковых эпителиальных клеток с использованием фидерные клетки и ингибитор ROCK был описан в 2012 году Лю и др. 2 3. Эта методика была использована для расширения раковыми эпителиальные клетки, полученные из биопсии простаты и рака молочной железы с использованием облученные фидерные клетки, ингибитор ROCK и условно перепрограммирование среды. Цель состояла в том, чтобы генерировать достаточное количество клеток для анализов в пробирке , таких как скрининг наркотиков. Этот метод способен расширяться эпителиальные клетки на неопределенное время "перепрограммирования" этих клеток к стержню или прародитель, как государство, которое является весьма пролиферативного. Было показано , что эти клетки не являются онкогенными и не обладают способностью образовывать тератомы 23, 24. Кроме того, нетхромосомные аномалии или генетических манипуляций присутствовали после пересева этих клеток в культуре с помощью этой техники 23, 24. Самое главное, что эти клетки только способны дифференцироваться в собственный тип клеток, представляющих интерес. Таким образом, эта методика предлагает большой резервуар конкретного пациента эпителиальных клеток для исследования болезни или тканевой инженерии без необходимости в иммортализации.
Получение эпителиальной ткани от конкретного органа с целью изучения процессов болезни часто ограничена и не всегда возможно из-за риска пациента. Для тех пациентов, страдающих от болезни пищевода или дефектов, извлечение эндоскопическая биопсия является минимально инвазивной подход для получения эпителиальной ткани, которая может быть отделено и условно перепрограммировать, чтобы обеспечить неопределенный источник клеток, который является специфическим для слизистой оболочки пищевода, который пациента. Затем это позволяет для исследований в пробиркеэпителиальных клеток для оценки процессов, заболеваний и экран для потенциальных терапевтических средств. Один процесс болезни , которые могли бы извлечь большую пользу от этого подхода является то, эозинофильный эзофагит, которая была описана как аллергическое заболевание пищевода 8. Тесты аллергии, а также терапевтические подходы могут быть оценены в пробирке , используя собственные эпителиальные клетки пациента , и эти данные затем могут быть переданы на лечащего врача для разработки индивидуальных планов лечения. Методика условного перепрограммирования в сочетании с получением эндоскопических биопсий из педиатрической предлагает возможность расширить нормальные эпителиальные клетки пищевода на неопределенное время из любого пациента. Таким образом, этот источник клеток может быть совместно вместе с натуральным или синтетическим подмостей для обеспечения конкретного пациента хирургической манипуляции на наличие дефектов, болезни или травмы. Имея неограниченное число клеток поможет спроектировать пищеводу конструкции, которые обладают совершенно пересевалилюмена с пищеводной эпителиальными клетками, с тем чтобы помочь облегчить регенерацию остальных типов клеток.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Пищеводу биопсии были получены после того, как было получено информированное согласие от родителей / опекунов педиатрических пациентов и в соответствии с этическими комитетами (IRB # 13-094).
1. стерилизуя Приборы и желатиновый раствор
- Автоклавы щипцы, лезвия бритвы и ножницы перед началом работы ткани, чтобы предотвратить загрязнение.
- Для того, чтобы 200 мл 0,1% раствора желатина, смешайте 200 мл дистиллированной воды с добавлением 0,2 г желатина. Автоклав и прохладный перед использованием.
2. Нанесение покрытий Пластины тканевой культуры
- Примерно 2 ч до выделения клеток, добавляют достаточное количество 0,1% желатина, чтобы покрыть блюдо культуры ткани (100 мм) и инкубировать при 37 ° С в инкубаторе для клеточных культур.
Примечание: Эти пластины могут также быть сделаны заранее и держали в инкубаторе перед использованием.
3. Создание ферментного решение для Разобщения
- Примерно за 30 минут до выделения клеток, отвесить10 единиц диспаза на балансе на основе единиц концентрации миллиграмм на флаконе. Поместите порошок в 15 мл коническую пробирку с 10 мл Дульбекко в модификации Дульбекко (DMEM), и поместите в водяной бане 37 ° C.
4. Создание среды для культивирования клеток
- Для того, чтобы 50 мл условного перепрограммирования среды, смешивают следующие ингредиенты в стерильную коническую пробирку: 35 мл F12 (Хэма Medium), 11,5 мл DMEM, 0,5 мл L-глутамина, 0,5 мл 100х пенициллина / стрептомицина, 2,5 мл эмбриональной телячьей сыворотки (FBS), 250 мкг человеческого инсулина, 500 нг человеческого эпидермального фактора роста (EGF).
- Для того, чтобы 500 мл среды 3Т3, смешайте 50 мл ФБС, 5 мл 100x пенициллина / стрептомицина и 5 мл L-глутамина с помощью 500 мл DMEM.
- Для того, чтобы 500 мл кератиноцитов бессывороточной среде, оттаивать EGF и бычий гипофизарный экстракт (BPE) добавки (при условии со средствами массовой информации). Добавьте добавки в мл бутылку базовой среды 500 и добавить 5 мл 100x пенициллин / стрептомицин
5. Культивирование и облучая 3Т3 в качестве фидера Источник
- Подготовьте 3Т3 среду, содержащую DMEM, 10% FBS, 1x пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
- Культура 3T3 клетки в ткани обработанных Т-75 колб , по крайней мере за 3 дня до прибытия образцов пациентов.
- Незадолго до прибытия образцов пациентов, Trypsinize 3Т3 с использованием 5 мл 0,25% трипсин-ЭДТА в колбу и инкубировать при температуре 37 ° С в течение 5 мин или до большинства клеток являются плавающими
- Добавляют 5 мл 3Т3 среды, чтобы остановить реакцию. Аспирируйте клеточной суспензии и переносят в 15 мл коническую трубку. Спин в течение 5 мин при 300 х г.
- Аспирируйте среду и клетки вновь суспендируют в определенном объеме трипанового синего для подсчета клеток. Смешайте 10 мкл клеток с 10 мкл трипанового синего, чтобы исключить мертвые клетки. Нагрузка 10 мкл этого раствора на гемоцитометра для подсчета клеток.
Примечание: Для этого протоCol, плотность посева для облученных 3T3 клеток 10,900 клеток на см 2, которая равна 600000 клеток на мм пластины 100. - Алиготе количество клеток, необходимых для пластины размерами 100 мм пластины каждого образца пациента и ресуспендируют в 25 мл среды 3T3 в 50 мл коническую пробирку и облучать с 3000 рад.
- После облучения спиновые клетки в течение 5 мин при 300 х г и ресуспендируют в условной перепрограммирования среде при 5 мл на 100 мм пластины.
- Установите трубку в сторону, пока покрытие из клеток пациента не происходит позже в протоколе (см шаг 7.6).
6. Получение, сохранение и транспортировка педиатрических к пищеводу биопсий
- Добавьте 5 мл полной кератиноцитов бессывороточной среде с 100 мкг / мл primocin до 15 мл конические пробирки и довести его до медицинского учреждения на льду.
Примечание: Эти трубки среды можно хранить при температуре 4 ° С в течение до 2-х месяцев. - Получают около 8 пищеводу биопсию на ТИмне эндоскопии и отдельно следующим образом:
- Поместите шесть биопсий в 15 мл коническую, содержащей полный кератиноцитов безсывороточную среду 100 мкг / мл primocin и помещают на влажный лед.
- Поместите одну биопсию в 5 мл забуференного формалина и помещают на влажный лед.
- Положите одну биопсию в небольшой биопсии cryomold с оптимальным соединением температуры резки.
- Сразу уронить эту форму в стакан изопентана помещенных в жидкий азот. После того, как замороженный, поместите cryomold в образце мешок и хранить на сухом льду в контейнере из пенополистирола.
- Поместите пробирки с биопсий в среде или формалином внутри запечатанный пакет, а затем в транспортную коробку, содержащую влажный лед. Печать и пометить коробку с этикеткой и биологической опасности его транспортировки в лабораторию.
Примечание: Контейнер, содержащий сухой лед и замораживают биопсия также запечатаны и маркированы с этикеткой биологической опасности.
7. ОбработкаТкань пациента вниз по течению культуры и анализа
- По прибытии в лабораторию, передать замороженные биопсию на сухом льду до -80 ° C морозилку вниз по течению секционирования или экстракции РНК. Поместите образец в формалин. Хранить в 4 ° C холодильнике и позволяют фиксировать в течение ночи.
- Спин оставшиеся биопсий вниз на 300 мкг, и аспирата среду. Добавьте 10 мл диспаза раствора в конической трубе, уплотнение и позволить ему инкубировать при 37 ° С в водяной бане в течение 15 мин.
- После инкубации, спина биопсий вниз при 300 х г. Аспирация средних и ресуспендируют биопсий в 5 мл 0,05% трипсин-ЭДТА.
- Передача 5 мл трипсин-ЭДТА, содержащего биопсий стерильно пластины 100 мм и пропустить через мясорубку биопсии с использованием 2 стерилизованные лезвия бритвы, как хорошо, как это возможно.
- Переносят 5 мл трипсин-ЭДТА, содержащего фарша биопсий к новой 15 мл коническую. Промыть пластину дважды с дополнительным 5 мл 0,05% трипсин-ЭДТА и добавить к коническойтрубка. Инкубируйте пробирку в течение 10 мин в C водяной бане при 37 °.
- После инкубации отжимать вниз биопсий при 300 х г (1,4 оборотов в минуту) в течение 5 мин и аспирата среду. Добавьте 5 мл условного перепрограммирования среды в конической трубе, а также 5 мл условного перепрограммирования среды, содержащей фидерные клетки, облученные (этап 5.7).
- Добавить ингибитор ROCK (1 мкл / мл) в 10 мл суспензии клеток и пластины после того, как аспирационных желатина из тканевой культуры блюдо. Инкубируют при 37 ° С.
8. Культивирование и расширяющихся клетки
- Примерно через 5 дней культивирования, аспирация исходную среду, содержащую кусочки фарша биопсии и прополоскать блюду 2-3 раза 5 мл стерильной PBS. Добавить новую среду к пластине, включая ингибитор ROCK при 10 мкМ.
- При достижении 70% слитности, расширить клетки. Добавить 5 мл 0,05% трипсин-ЭДТА к пластине и инкубировать в 37 ° C инкубаторе не более 2,5 мин для удаления тысе фидерные клетки. После этой инкубации, аспирация трипсин-ЭДТА и промыть пластины с 5 мл PBS.
- Аспирируйте PBS и добавляют 5 мл 0,25% трипсин-ЭДТА к пластине и инкубировать в течение 5-10 мин или пока клетки свободны от пластины. Добавить равное количество среды к пластине, чтобы остановить реакцию, и передача всей текучей среды в 50 мл коническую пробирку и спином вниз со скоростью 300 мкг в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клеток в определенном объеме условного перепрограммирования среды и смешивают 10 мкл суспензии с 10 мкл трипанового синего. Рассчитывать на гемоцитометра, чтобы определить общее количество клеток.
- Для расширения клетки, добавляют 1 миллион клеток человека к пищеводу до 150 мм пластины в вместе с 1200000 облученный 3Т3 в общем объеме 15 мл. Добавить ингибитор свежий ROCK на 10 мкм и добавить клеточной суспензии в желатин покрытием 150 мм блюдо.
9. замораживания и хранения человеческого пищеводного эпителиальные клетки
- Для того, чтобы замораживании среду, добавьте 10%ДМСО условной перепрограммирования среде. После того, как trypsinizing и подсчета, Аликвотировать клетки замораживать в новый 50 мл коническую пробирку и спином вниз со скоростью 300 мкг в течение 5 мин.
- Аспирируйте среды и добавить замораживании среду в объеме 2 мл на криопробирку. После того, как клеточная суспензия однородна, аликвоты 10 6 клеток в предварительно меченных cyrovials. Поместить в контейнер замораживанием при -80 ° С в течение, по крайней мере за 24 ч до перемещения ампул к длительному хранению жидкого азота.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Краткое изложение основных шагов в выделении пищевода эпителиальных клеток из биопсий пациентов приводится на рисунке 1. Колонии эпителиальных клеток будет формироваться в примерно 4-5 дней и будут окружены фидерных фибробласты (рис 2А). Поскольку эти колонии расширения они будут сливаться с другими колониями, образуя большие колонии (рис 2В). После того , как культуры стали 70% сливающиеся, они должны быть расширены (рис 2C). Для того, чтобы гарантировать, что фибробласты снимают с пластинки перед удалением эпителиальные клетки, 0,05% трипсин-ЭДТА используется до 2,5 мин, чтобы удалить кормушки. Отсутствие питателей должно выглядеть как на рисунке 2D. Адгезивные эпителиальные клетки затем обрабатывают трипсином с 0,25% трипсин-ЭДТА и пересевали на новых облучаемых клеток фидерных (рис 2E).
(рис 3A ). Эти клетки также анализировали при прохождении 1 на эпителиальных маркеров через проточной цитометрии и больше , чем 90% клеток , присутствующих из трех пациентов были положительными на EpCAM (фиг.3В). Клетки также анализировали с помощью иммунофлуоресценции на пассажей 1 и 3 чтобы обеспечить фенотип над этими 3 пассажей не меняется. Окрашивание демонстрирует сохранение эпителиальной маркера Е-кадгерина (рис 4A-D), предок маркер Р63 (рис 4E-Н), маркер пролиферации Ki-67 (рис 4i-L) , и эпителиальный плотный узел белок TJP1 (рис 4М-П ).
И, наконец, кривая роста была построена с использованием линии клеток из не пораженной пациента, чтобы оценить время удвоения этих клеток в условной перепрограммирования культуре. Клетки высевали при 100000 клеток на 0 -й день , и было обнаружено, что лишь немногим более 500000 клеток на 4 день (рисунок 5). Рассчитывали время удвоения составляет приблизительно 36-40 ч. Ожидается, что больные клетки будут иметь более медленный удваивалась, однако, каждый пациент должен оцениваться отдельно для учета индивидуальных различий.
1 ">
Рисунок 1: Обзор изоляции и Культивирование человеческого пищеводного эпителиальных клеток из педиатрических Биопсию. Биопсии получены из педиатрических пациентов после информированного согласия и транспортируются в кератиноцитов бессывороточной среде в лабораторию. Эти биопсий затем обрабатывают 1 Ед / мл диспаза, с последующим мясорубки ткани стерильными лезвиями и, наконец, обработку с 0,05% трипсин-ЭДТА. Суспензию клеток затем добавляли к облученным фидерных клеток в условной перепрограммирования среде. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Культивирование и расширение человеческого пищеводного эпителиальные клетки. Через 5 дней в условно-перепрограммируетMing среда, относящаяся к пищеводу эпителиальные клетки начинают образовывать небольшие булыжником колонии (А), что в конечном итоге сливаются в более крупные колонии (B). После того , как блюдо культуры ткани достигает 70% сплошности (С), пластины обрабатывают в течение очень короткого времени , с 0,05% трипсин-ЭДТА , чтобы удалить фидерные клетки, при этом сохраняя прилипание эпителиальных клеток (D). Эпителиальные клетки затем удаляют с 0,25% трипсин-ЭДТА и пересевали с новыми питающими клетками. Всего через 24 ч после разделения этих клеток они образуют новые колонии и продолжают размножаться (E). Кратность 100X. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Проточная цитометрия и QRT-PCR анализ клеток разложена в культуре. (А) представитель экспрессии генов клеток в культуре при прохождении 1 условного перепрограммирования продемонстрировал увеличение в 6 раз в экспрессии P63, маркера клеток - предшественников, а также уменьшение в эпителиальные маркеры CDH1 и TJP1 по сравнению с генной экспрессии биопсии. Это указывает на то популяция клеток находится в более прародителей, как состояние и, следовательно, является более высокой пролиферативной. Экспрессия генов 24 ч после перепрограммирования (после удаления питающих клеток и ROCK Ингибитор) демонстрирует повышенную экспрессию CDH1 и TJP1, а снижение экспрессии P63. (В) Анализ проточной цитометрией клеток от нескольких пациентов , полученных при прохождении 1 показывают большее , чем 90% клеток , экспрессирующих EpCAM. Пациент 27 представляет собой нелитиевыми Eoe пациента, в то время как пациенты 26 и 28 представляют собой клетки пациента Eoe. Пожалуйста , нажмите здесь , тO просмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: иммунофлуоресценции Окрашивание клеток при Проходы 1 и 3. Клетки , выращенные в условной перепрограммирования среде с облученными питающими клетками экспресс - Е-кадгерин (А - Д), а также прогениторных маркер Р63 (Е - Н). Эти клетки все еще пролиферативная при прохождении 3 (I - L). Наконец, эти клетки экспрессируют белок плотных соединений 1 (TJP1), что также согласуется с эпителиального фенотипа (M - P). Ядра контрастно с DAPI (синий) и антитела обнаруживаются с помощью Alexa Fluor 546 антитела (оранжевый). 2 - й Антитело (Ab) управления представляет собой неспецифическое связывание вторичного антитела к ткани (Q, R). Шкала баров = 50мкм. Кратность 200X. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Рост Кривая клеток в условных перепрограммирования. Клетки в условной среде перепрограммирования из не-заболевшего пациента были посеяны при определенной плотности и размножается трех подсчитывали каждый день в течение 4-х дней. Кривая роста была сгенерирована с использованием этих кровяных клеток и время удвоения была рассчитана на основе полученных чисел на 4-й день и День 0. время удвоения этих клеток составляет приблизительно 36-40 ч. Отрезки ошибок указывают на стандартные ошибки. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важные шаги для того, чтобы изолировать и расширить пищеводу эпителиальные клетки из биопсий пациентов являются: 1) адекватно отделяя биопсии ткани с минимальной клеточной гибели; 2) обеспечить ингибитор ROCK добавляют в среду для культивирования клеток при каждом изменении среды; 3) Не используйте больше фидерных клеток, чем рекомендуется; 4) поддерживать чистую асептическую культуру; и 5) прохождение клетки только до достижения слияния.
Из-за различий связанных с пациентом в образцах биопсии, полученных для условной перепрограммирования, то разумно ожидать различий в кинетике роста, фенотипа и возможностью расширения на несколько проходов. Как правило, 4 биопсий пищеводные получают из каждого пациента для выделения клеток. После того, как диссоциирует, мы чистая приблизительно 300,000-600,000 клеток на день 0. Это расширяет более 10 миллионов клеток при прохождении 3 в среднем. Морфология колоний, которые образуют должно выглядеть подобно булыжником морфологии, описанной для эпителиальных клеточных линий <вир класс = "Xref"> 25 (рисунок 2). Образец клеток в культуре должны быть проанализированы с помощью QRT-PCR, проточной цитометрии и иммунофлюоресценции для эпителиальных маркеров для обеспечения популяции расширяющиеся действительно эпителиального происхождения (рисунок 3). В случае если клетки не экспрессируют эпителиальные маркеры (Е-кадгерин, EpCAM, TJP1), клеточная линия должна быть прекращена и отбрасывают. Ожидается, что более 90% клеток, присутствующих являются ЕрСАМ положительными, если они эпителиальными по своему происхождению. Для того чтобы оценить, если культуры меняют фенотип или потери эпителиальной экспрессии, иммунофлюоресценции или поточной цитометрии, должны быть использованы для оценки эпителиальные маркеры (Е-кадгерина), экспрессия прогениторных (Р63), и эпителиальные плотных соединений белки (TJP1). По мере того как клетки пассируют, ожидается , что фенотип не должно измениться, распространение не должно уменьшаться , и эти клетки должны отображать эпителиальную экспрессию, а также экспрессию клеток - предшественников (рисунок 4 (рисунок 5). Клетки, которые находятся не в два раза больше, чем за 5 дней, вероятно, будут стареющей и должны быть отброшены.
Было описано , что клетки , выделенные от больных с воспалительными процессами , присутствующих, например, EoE, обладают эпителиальные клетки , которые имеют уменьшенный пролиферативную скорость, снижение экспрессии Е-кадгерина (рис 3, пациенты 26 и 28) и высокую скорость апоптоза 26. Поэтому не лишено смысла испытывать трудности культивирования клеток с тяжелобольным, используя этот метод. Вполне возможно, что клетки будут только выдержать несколько проходов или даже только первоначальный проход. Это должно по-прежнему предоставить исследователю с большим количеством ячеек, чем первоначально изолированы. Тем не менее, это число не может быть адекватнойдля всех предложенных исследований. Так как эти клетки используются для того чтобы в конечном итоге изучения заболевания пищевода или построить пищеводный замену, важно помнить, эти клетки отвечают только для регенерации слизистой оболочки. Другие типы клеток, такие как фибробласты, нейроны, клетки гладких мышц и кровеносных сосудов также являются столь же важное значение для изучения болезни пищевода и для тканевой инженерии.
Этот метод предлагает конкретного пациента источник клеток, что является бесценным инструментом для изучения патогенеза болезни, а также служит в качестве потенциального резервуара клеток пациента специфических для тканевой инженерии пищеводу. Клетки, используемые для посева биоматериалы для хирургической имплантации должны быть свободны от генетических аномалий, вирусных последовательностей и не образуют тератомы. Использование стволовых клеток (мультипотентных или плюрипотентных) генерирует слишком много типов нежелательными клеток после дифференцировки, некоторые из которых могут образовывать тератомы, если они не претерпевали диффереференцирование. Кроме того, этот источник клеточный фенотип последовательна и не требует очистки или удаления нежелательных клеток. Источник идеальной ячейка будет представлять собой клетки, которые находятся в том же месте, что анатомическое является проектируется. При таком подходе эти пищеводу эпителиальные клетки используются для заселить слизистую оболочку пищеводного эшафот. Дополнительные типы клеток необходимы для регенерации пищевода; Тем не менее, в центре внимания этой методики в том, чтобы обеспечить слизистую оболочку пересева и не неполным, так как это может вызвать утечку жидкости, стриктуры и перфорации.
В дополнение к использованию этих клеток для инженерных новых хирургических вариантов для пищевода, эти клетки также могут быть использованы для изучения пищеводу болезненных процессов, а также экран для новых терапевтических подходов для лечения этих условий. Эозинофильный эзофагит (EoE) описывается как аллергическое заболевание пищевода, с точным механизмом и патогенеза еще не полностью описаны. Текущий рег лечениепериментов являются нейтрализация диеты, оральные стероиды и множественные эндоскопию. Ни один тест не существует для того чтобы оценить, что вызывает воспалительный процесс для каждого пациента, что приводит врачей использовать "угадать и проверки" подход, который долго и часто расстраивает для пациента. Так как этот метод разложения клеток конкретного пациента не использует лентивирусов трансдукции или генетической модификации, возможность постоянных изменений в генотипе клеток из процесса перепрограммирования минимальна. Это означает , что клетки теоретически остаются неизменными из окружающей среды в естественных условиях. Возможность испытать клетки пациента в пробирке , чтобы идентифицировать инициирующее вещество будет новым и в конечном счете может привести к развитию новых методов диагностики и терапевтических средств для лечения этих больных детей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100 mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150 mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50 mL Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25 mL Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
References
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the 'hybrid construct' approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. Molecular Cell Biology. , W.H. Freeman. New York. (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
