التعبير، تنقية، ومضادات الميكروبات النشاط من S100A12
Summary
هنا، نقدم طريقة للتعبير عن وتنقية S100A12 (كالغرانولين C). نحن تصف بروتوكول لقياس نشاطها المضادة للميكروبات ضد الممرض البشري H. بيلوري .
Abstract
بروتينات كالغرانولين هي وسطاء مهمين من الحصانة الفطرية وهي أعضاء في فئة S100 من الأسرة إف اليد من البروتينات ملزمة الكالسيوم. بعض البروتينات S100 لديها القدرة على ربط المعادن الانتقالية مع تقارب عالية وعزلها بشكل فعال بعيدا عن غزو مسببات الأمراض الميكروبية في عملية تسمى "الحصانة الغذائية". S100A12 (إن-ريج) يربط كلا من الزنك والنحاس وفيرة للغاية في الخلايا المناعية الفطرية مثل الضامة والعدلات. نحن تقرير طريقة المكرر للتعبير، تخصيب وتنقية S100A12 في نشط، تكوين ملزم المعادن. استخدام هذا البروتين في نمو البكتيريا والتحليلات البقاء على قيد الحياة يكشف أن S100A12 له نشاط مضاد للميكروبات ضد الممرض البكتيرية ، هيليكوباكتر بيلوري . ويستند النشاط المضاد للميكروبات على النشاط ملزم الزنك من S100A12، الذي يخلط الزنك المغذي، وبالتالي تجويع H. بيلوري الذي يتطلب الزنك للنمو و proliferation.
Introduction
بروتينات S100 هي فئة من الأسرة EF- اليد من البروتينات ملزمة الكالسيوم مع مجموعة متنوعة من الوظائف 1 . يتم التعبير عنها بطريقة الأنسجة والخلية محددة، وتنظيم مجموعة واسعة من الوظائف الخلوية 2 ، 3 . فريدة من نوعها لبروتينات الكالسيوم ملزمة، بروتينات S100 المعرض على حد سواء وظائف داخل الخلية وخارج الخلية 4 ، 5 . داخل الخلية، كا 2 + ملزمة يؤدي إلى تغيير كونفورماتيونال الذي يعرض سطح مسعور الذي يستهدف على وجه التحديد البروتين شركاء ملزم 6 . هذه الآلية داخل الخلايا ينظم العمليات الهامة مثل تكاثر الخلايا، والتمايز والتمثيل الغذائي للطاقة. في الوسط خارج الخلية، بروتينات S100 تظهر وظيفتين 7 . في واحدة، أنها بمثابة الضرر المرتبطة الجزيئية نمط (دامب) البروتينات والشروع في المؤيدة للالتهاباتأتوري الاستجابة المناعية من خلال التفاعل مع مستقبلات التعرف على نمط 8 ، 9 . بالإضافة إلى ذلك، العديد من أعضاء فئة البروتين S100 عزل انتقال المعادن، وهي وظيفة التي تعمل على تجويع مسببات الأمراض الميكروبية في عملية تسمى الحصانة الغذائية 10 ، 11 .
S100A12 (المعروف أيضا باسم كالغرانولين C و EN- ريج) وأعرب للغاية في الضامة والعدلات وتم التعرف على أنها العلامات البيولوجية المحتملة للأمراض الالتهابات 12 ، 13 . بالإضافة إلى الكالسيوم ملزمة في مواقع EF- اليد، S100A12 اثنين من تقارب عالية الانتقال المعادن مواقع ملزمة تقع على طرفي نقيض من واجهة ديمر 14 ، 15 . ويتكون كل موقع ملزم من ثلاثة مخلفات الحامض الاميني وبقايا حمض الأسبارتيك واحد ويمكن أن تشيلت الزنك أو النحاس <سوب كلاس = "كريف"> 16 ، 17 . في الآونة الأخيرة، أبلغنا أن المجاعة الزنك تعتمد على S100A12 مهم في تنظيم هيليكوباكتر بيلوري النمو ونشاط عوامل الفوعة المؤيدة للالتهابات 18 .
H. بيلوري يصيب المعدة من حوالي نصف سكان العالم في العالم. مما يجعلها واحدة من أنجح الممرضات البكتيرية 19 . العدوى مع H. بيلوري يمكن أن يؤدي إلى نتائج مرض المعدة كبيرة بما في ذلك التهاب المعدة والقرحة الهضمية الاثني عشر، الغشاء المخاطي المرتبطة الأنسجة اللمفاوية (مالت) سرطان الغدد الليمفاوية، وغدية المعدة الغازية (سرطان المعدة). سرطان المعدة هو السبب الرئيسي للوفيات غير المرتبطة بالسرطان غير القلب في العالم، وأكبر عامل خطر واحد المرتبطة بسرطان المعدة هو العدوى مع H. بيلوري .
H. بيلوري يستمر في مكانة المعدة على الرغم من روبواستجابة المناعة المناعية للممرض، مما يؤكد الحاجة إلى فهم أفضل للآليات المناعية للسيطرة على هذه العدوى البكتيرية 20 ، 21 ، 22 ، 23 . يتميز بيلوري- التهاب مترافق مع تسلل عميق من الخلايا النوى متعددة النوى، أو العدلات، التي تودع ذخيرة من البروتينات المضادة للميكروبات، بما في ذلك S100A12، في موقع العدوى 18 ، 24 ، 25 . في محاولة لفهم الحوار المعقدة بين المضيف والممرض، سعينا إلى صقل تقنية لتنقية S100A12 واستخدامها لدراسة مضادات الميكروبات تؤثر عليه يمارس على هذا الممرض ذات الصلة طبيا. بروتوكول أدناه الخطوط العريضة تقنية محسنة لتنقية S100A12 في حالتها النشطة بيولوجيا. قادرة على ملزمة المعادن المغذية مع أفيني عاليةتي وخالب لهم بعيدا عن غزو الكائنات الحية الدقيقة. وعلاوة على ذلك، الأساليب أدناه تسليط الضوء على فائدة هذا البروتين كاشف حاسم لدراسة الآلية التي الجزيئات المضادة للميكروبات الفطرية تقيد نمو مسببات الأمراض البكتيرية.
وقد اكتسبت البروتينات S100A الأسرة التقدير كمجموعة هامة من جزيئات نظام المناعة الفطرية التي تشارك في إشارة المناعة وكذلك الدفاع المضيف 27 . الأكثر دراستها جيدا هي كالبروتكتين (مرب-8/14، كالغرانولين A / B، S100A8 / A9) 28 ، 29 ، 30 . كالبروتكتين هو البروتين المرتبط العدلات التي تشكل هيتيروديمر من S100A8 و S100A9 الوحدات الفرعية التي تربط الانتقال المعادن في واجهة ديمر 31 . وقد تبين أن كالبروتكتين تمتلك اثنين من المواقع الملزمة المعدنية: الموقع 1 يمكن ربط زن 2+ ، من 2+ ، أو الحديد 2+ ، والموقع 2 يمكن ربط زن 2+ 31 ، 32 . وقد أظهرت العديد من التقارير أن الكالبروتكتين لديها أنشطة مضادات الميكروبات ضد مسببات الأمراض المتنوعة بما في ذلك المكورات العنقودية الذهبية ، المبيضات البيض ، أسينتوباكتر بوماني ، كليبسيلا الرئوية ، الإشريكية القولونية ، والبكتيريا الحلزونية ، وأن الآثار المثبطة هي نتيجة لأنشطة خالب المعادن من كالبروتكتين 25 ، 28 ، 29 .
العمل السابق أظهرت كالبروتكتين تمارس العديد من الأنشطة على H. بيلوري بما في ذلك تغيير الدهون في هيكل في الغشاء الخارجي، وقمع كاج-نوع الرابع إفراز النظام (وهو عامل فوعة بروينفلاماتوري كبير داخل H. بيلوري )، وتحفيز تشكيل بيوفيلم، وقمع H. بيلوري النمو والصلاحية بطريقة تعتمد على الجرعةكلاس = "كريف"> 25 ، 33 . وعلاوة على ذلك، كشفت الفحوصات الجينية والكيمياء الحيوية النشاط المضاد للبكتيريا من الكالبروتكتين ضد H. بيلوري كان مستمدا إلى حد كبير من قدرته على ربط الزنك المغذيات 25 . يتطلب البوابية الزنك، كما تم تحديده من قبل البحوث السابقة التي تستخدم وسيلة محددة كيميائيا للتأكد من متطلبات المغذيات الدقيقة لهذا الممرض في النمو وتكاثر 34 . بالإضافة إلى ذلك، كان الكالبروتكتين وفيرة للغاية داخل الأنسجة الحلزونية الملوية البوابية ، ويرتبط مع تسلل العدلات، مشيرا إلى المضيف قد يكون توظيف الكالبروتكتين كاستراتيجية مضادات الميكروبات خلال العدوى والالتهاب اللاحق 25 ، 35 .
تشير الأدلة الحديثة من تقنيات التحري البروتيني غير منحازة أنه في ظل ظروف حيث الأكسجين التفاعلية الأنواع وفيرة، كالبروتيكالقصدير يخضع التعديلات بعد متعدية التي تغير سداسي الهستيدين ملزم الموقع، وبالتالي تثبيط نشاط ملزم المعادن من البروتين 36 . على هذا النحو، افترضنا أن بروتينات أخرى S100A الأسرة بين ذخيرة واسعة من هذه الجزيئات يمكن أن تكون بمثابة المعادن المساعدة-تشيلاتورس. اخترنا S100A12 لمزيد من الدراسة لأنه لم يتم تحديدها في الشاشة المذكورة أعلاه لتعديل ما بعد متعدية، لديها القدرة على ربط الزنك، وأنها وفيرة للغاية في الأنسجة البشرية المستمدة من H. بيلوري- المصابين بالعدوى.
عملنا يشير إلى أن S100A12 يمكن أن تمنع نمو البوابية وبقاء بطريقة تعتمد على الجرعة في سلالة G27 من H. بيلوري ، وأن النشاط المضاد للميكروبات من هذا البروتين يمكن عكسها عن طريق إضافة الزنك المغذيات الزائدة. هذا العمل يكمل عملنا السابق مشيرا إلى S100A12 النشاط المضاد للميكروبات ضد PMSS1 و 7.13 سلالات من الملوية البوابية ، مما يدل على نشاطها المضاد للبكتيريا واسعة ضد العديد من العزلات السريرية والسلالات المختبرية تكييفها من H. بيلوري 18 . معا، هذه النتائج تؤكد أهمية S100A12 كآلية للسيطرة على نمو البكتيريا وانتشارها عن طريق الحصانة الغذائية. الدراسات المستقبلية لهذا التفاعل المضيف البكتيرية الهامة يمكن أن تشمل استغلال نشاط S100A12 للحد من العبء البكتيرية داخل أنسجة المضيف، أو تحديد مساهمة هذا البروتين في الإشارات المناعية في سياق عدوى الملوية البوابية .
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد بروتوكول كفاءة لكل من التعبير وتنقية S100A12 الإنسان. نظام التعبير E. القولونية هو الأداة الأكثر شيوعا المستخدمة لإنتاج البروتينات المؤتلف، وخصوصا عندما تكون هناك حاجة كميات ملغ للدراسات البيوكيميائية والبيوفيزيائية. وهناك تعزيز رئيسي للإجراء الموصوف هنا هو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد أيد هذا البحث من قبل وزارة شؤون المحاربين القدامى جائزة التطوير الوظيفي 1IK2BX001701، كتسا جائزة UL1TR000445 من المركز الوطني للنهوض العلوم الانتقالية، ومؤسسة العلوم الوطنية جائزة أرقام 1547757 و 1400969، والمعاهد الوطنية للصحة منح GM05551. محتوياته هي وحدها مسؤولية المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمركز الوطني للنهوض العلوم الانتقالية أو المعاهد الوطنية للصحة.
Materials
| S100A12 Expression | ||
| Expression cells | ||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 |
| Autoinduction medium components | ||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 |
| Selection agent | ||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 |
| S100A12 Purification | ||
| AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 |
| Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 |
| H. pylori Culture | ||
| Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 |
| Cholesterol (250X) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
References
- Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
- Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).
- Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).
- Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
- Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).
- Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).
- Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).
- Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
- Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).
- Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).
- Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).
- Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).
- Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).
- Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).
- Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).
- Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).
- Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).
- de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).
- Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).
- Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).
- Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
- Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).
- Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).
- Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).
- Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).
- Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
- Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).
- Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).
