Expressie, zuivering en antimicrobiële activiteit van S100A12
Summary
Hier presenteren we een methode om S100A12 (Calgranulin C) uit te drukken en te zuiveren. We beschrijven een protocol om zijn antimicrobiële activiteit tegen het menselijke pathogeen H. pylori te meten.
Abstract
Calgranulin eiwitten zijn belangrijke mediators van aangeboren immuniteit en zijn leden van de S100 klasse van de EF-hand familie van calcium bindende eiwitten. Sommige S100-eiwitten hebben de mogelijkheid om overgangsmetalen te binden met een hoge affiniteit en ze kunnen ze effectief wegvallen van invallende microbiële pathogenen in een proces dat "voedingsimmuniteit" wordt genoemd. S100A12 (EN-RAGE) bindt zowel zink als koper en is zeer overvloedig in aangeboren immuuncellen, zoals macrofagen en neutrofielen. We rapporteren een verfijnde methode voor de expressie, verrijking en zuivering van S100A12 in zijn actieve, metaalbindende configuratie. Gebruik van dit eiwit in bacteriële groei en levensvatbaarheidsanalyses laat zien dat S100A12 antimicrobiële activiteit heeft tegen het bacteriepatogen, Helicobacter pylori . De antimicrobiële activiteit is gebaseerd op de zinkbindende activiteit van S100A12, die chloorvoedingszink chelaat, waardoor H. pylori verhongert, wat zink vereist voor groei en proliferation.
Introduction
S100 eiwitten zijn een klasse van de EF-hand familie van calcium bindende eiwitten met een uiteenlopende reeks functies 1 . Ze worden uitgedrukt in een weefsel- en celspecifieke manier en regelen een breed spectrum van cellulaire functies 2 , 3 . Uniek voor calciumbindende eiwitten, S100-eiwitten vertoonden zowel intracellulaire als extracellulaire functies 4 , 5 . Binnen de cel veroorzaakt Ca 2+ binding een conformatieve verandering die een hydrofoob oppervlak blootstelt dat specifiek op eiwitbindende partners 6 staat . Dit intracellulaire mechanisme regelt belangrijke processen zoals cel proliferatie, differentiatie en energie metabolisme. In het extracellulaire milieu hebben S100 eiwitten twee functies 7 . In een, fungeren ze als schade geassocieerde moleculaire patroon (DAMP) eiwitten en initiëren een pro-inflammatoireAtoom immuunrespons door interactie met patroonherkenningsreceptoren 8 , 9 . Daarnaast hebben meerdere leden van de S100 proteïne klasse sequester overgangsmetalen, een functie die dient om microbiële pathogenen te verhongeren in een proces genaamd voedingsimmuniteit 10 , 11 .
S100A12 (ook bekend als calgranulin C en EN-RAGE) wordt sterk uitgedrukt in macrofagen en neutrofielen en is geïdentificeerd als een potentiële biomarker voor ontstekingsziekten 12 , 13 . Naast bindend calcium op zijn EF-Hand-plaatsen heeft S100A12 twee hoge affiniteits-overgangsmetaalbindingsplaatsen, gelegen aan tegenover elkaar gelegen uiteinden van de dimerinterface 14 , 15 . Elke bindingsplaats bestaat uit drie histidine residuen en één asparaginezuurrest en kan zink of koper cheleren <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Onlangs hebben we gemeld dat S100A12-afhankelijke zinkhonging belangrijk is bij het reguleren van de groei van Helicobacter pylori en de activiteit van pro-inflammatoire virulentiefactoren 18 .
H. pylori infecteert de maag van ongeveer de helft van de menselijke bevolking van de wereld; Waardoor het waarschijnlijk een van de meest succesvolle bacteriële pathogenen is 19 . Infectie met H. pylori kan leiden tot significante gastrische ziekte-uitkomsten, waaronder gastritis, peptische en duodenale ulcus, mucosa geassocieerd lymfoïdweefsel (MALT) lymfoom, en invasieve maag adenocarcinoom (maagkanker). Maagkanker is de belangrijkste oorzaak van de niet-cardia-kankerverwante dood in de wereld, en de grootste risicofactor voor maagkanker is de grootste bijbehorende risicofactor bij H. pylori .
H. pylori blijft in de maag niche ondanks een robuustheidSt immuunrespons op het pathogeen, onderstrepen de behoefte aan een beter begrip van immuunmechanismen om deze bacteriële infectie 20 , 21 , 22 , 23 te beheersen. H. pylori- geassocieerde ontsteking wordt gekenmerkt door een diepgaande infiltratie van polymorfonucleaire cellen, of neutrofielen, die een repertoire van antimicrobiële eiwitten deponeren, waaronder S100A12, op de plaats van infectie 18 , 24 , 25 . In een poging om de complexe dialoog tussen gastheer en pathogeen te begrijpen, trachten we de techniek te verfijnen om S100A12 te zuiveren en te gebruiken om het antimicrobiële effect dat het uitoefent op dit medisch relevante pathogeen te bestuderen. Het protocol hieronder schetst een verbeterde techniek voor S100A12-zuivering in zijn biologisch actieve toestand; In staat om voedingsstoffen met hoge affini te bindenTy en cheleren ze weg van invasieve micro-organismen. Bovendien benadrukken de onderstaande methodes het nut van dit eiwit als een kritisch reagens om het mechanisme te bestuderen waarbij aangeboren antimicrobiële moleculen de groei van bacteriële pathogenen beperken.
S100A-familie eiwitten hebben op prijs gesteld als een belangrijke groep aangeboren immuunsysteem moleculen die deelnemen aan immuun signalering evenals gastheer verdediging 27 . De meest goed bestudeerde hiervan is calprotectine (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectine is een neutrofiele geassocieerde eiwit die een heterodimeer vormt van de S100A8- en S100A9-subeenheden die overgangsmetalen binden aan de dimerinterface 31 . Calprotectine is aangetoond om twee metaalbindingsplaatsen te bezitten: Site 1 kan Zn 2+ , Mn 2+ , of Fe 2+ binden en Site 2 kan Bind Zn 2+ 31 , 32 . Verschillende rapporten hebben aangetoond dat calprotectin antimicrobiële activiteiten tegen diverse pathogenen heeft, waaronder Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli en H. pylori , en dat de remmende effecten zijn te wijten aan de metaalchelatieactiviteit van calprotectin 25 , 28 , 29 .
Eerdere werkzaamheden aangetoond dat calprotectine talrijke activiteiten op H. pylori uitoefent, inclusief het veranderen van de lipide A-structuur in het buitenmembraan, onderdrukking van het cag- Type IV-secretiesysteem (dat een belangrijke proinflammatoire virulentiefactor binnen H. pylori is ), het induceren van biofilmvorming en het onderdrukken van H. pylori groei en levensvatbaarheid op een dosisafhankelijke manierClass = "xref"> 25 , 33 . Bovendien bleken genetische en biochemische analyses de antibacteriële activiteit van calprotectine tegen H. pylori te berusten, grotendeels afkomstig van zijn vermogen om nutriëntzink 25 te binden. H. pylori vereist zink, zoals werd bepaald door eerder onderzoek dat een chemisch gedefinieerd medium gebruikt om de micronutriëntvereisten voor dit pathogeen te bepalen om 34 te groeien en te prolifereren. Daarnaast was calprotectine zeer overvloedig in H. pylori- geïnfecteerde weefsels, en geassocieerd met neutrofiele infiltraten, wat aangeeft dat de gastheer calprotectine kan gebruiken als een antimicrobiële strategie tijdens infectie en daaropvolgende ontsteking 25 , 35 .
Recent bewijs van onbevooroordeelde proteomische screeningstechnieken suggereert dat onder omstandigheden waarin reactieve zuurstofsoorten overvloedig zijn, calprotecTin ondergaat post-translationele modificaties die de hexa-histidine bindingsplaats veranderen, waardoor de metaalbindende activiteit van het eiwit 36 wordt geremd. Als zodanig hebben we verondersteld dat andere eiwitten van de S100A-familie onder het brede repertoire van deze moleculen potentieel kunnen optreden als hulpmetaal-chelators. We hebben S100A12 geselecteerd voor verdere studie, omdat het niet werd geïdentificeerd in het voornoemde scherm voor posttranslatorische modificatie, het heeft de capaciteit om zink te binden en het is zeer overvloedig in menselijke weefsels afgeleid van H. pylori- geïnfecteerde individuen.
Ons werk geeft aan dat S100A12 de groei en de levensvatbaarheid van H. pylori op dosisafhankelijke wijze kan remmen in de G27-stam van H. pylori en dat de antimicrobiële activiteit van dit eiwit omgekeerd kan worden door toevoeging van overtollig nutriëntzink. Dit werk aanvult ons vorige werk dat S100A12 aangeeft dat antimicrobiële activiteit tegen PMSS1 en 7.1 heeft uitgeoefend3 stammen van H. pylori , die zijn brede antibacteriële activiteit aantonen tegen talrijke klinische isolaten en laboratorium aangepaste stammen van H. pylori 18 . Samen bevestigen deze resultaten het belang van S100A12 als een mechanisme om bacteriële groei en proliferatie via voedingsimmuniteit te beheersen. Toekomstige studies van deze belangrijke gastro-bacteriële interactie zouden onder meer de uitoefening van de activiteit van S100A12 kunnen omvatten om de bacteriële last in gastheerweefsels te verminderen of de bijdrage van dit eiwit aan immuun signalering in de context van H. pylori- infectie te bepalen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Een efficiënt protocol voor zowel expressie als zuivering van menselijke S100A12 wordt gepresenteerd. Het E. coli expressiesysteem is het meest voorkomende hulpmiddel dat wordt gebruikt voor de productie van recombinante eiwitten, met name wanneer mg hoeveelheden nodig zijn voor biochemische en biofysische studies. Een belangrijke verbetering van de hier beschreven werkwijze is het gebruik van auto-inductiemedia 26 die de opbrengst van gezuiverd eiwit verhoogt met een factor van bijna d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door het Department of Veterans Affairs Career Development Award 1IK2BX001701, CTSA-prijs UL1TR000445 van het National Center for Advancing Translational Sciences, de National Science Foundation Award Numbers 1547757 en 1400969, en NIH grant GM05551. De inhoud ervan is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs officiële opvattingen van het Nationaal Centrum voor de Bevordering van Vertaalwetenschappen of de National Institutes of Health.
Materials
| S100A12 Expression | ||
| Expression cells | ||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 |
| Autoinduction medium components | ||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 |
| Selection agent | ||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 |
| S100A12 Purification | ||
| AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 |
| Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 |
| H. pylori Culture | ||
| Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 |
| Cholesterol (250X) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
References
- Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
- Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).
- Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).
- Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
- Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).
- Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).
- Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).
- Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
- Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).
- Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).
- Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).
- Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).
- Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).
- Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).
- Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).
- Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).
- Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).
- de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).
- Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).
- Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).
- Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
- Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).
- Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).
- Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).
- Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).
- Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
- Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).
- Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).
