Expresión, purificación y actividad antimicrobiana de S100A12
Summary
Aquí, se presenta un método para expresar y purificar S100A12 (calgranulina C). Se describe un protocolo para medir su actividad antimicrobiana contra el patógeno humano H. pylori .
Abstract
Las proteínas de la calgranulina son mediadores importantes de la inmunidad innata y son miembros de la clase S100 de la familia EF de proteínas de unión al calcio. Algunas proteínas S100 tienen la capacidad de unirse a los metales de transición con alta afinidad y efectivamente secuestrarlos lejos de patógenos microbianos invasores en un proceso que se denomina "inmunidad nutricional". S100A12 (EN-RAGE) se une tanto al zinc como al cobre y es muy abundante en las células inmunes innatas, como los macrófagos y los neutrófilos. Presentamos un método refinado para la expresión, enriquecimiento y purificación de S100A12 en su configuración activa de unión a metal. La utilización de esta proteína en el crecimiento bacteriano y análisis de viabilidad revela que S100A12 tiene actividad antimicrobiana contra el patógeno bacteriano , Helicobacter pylori . La actividad antimicrobiana se basa en la actividad de unión a zinc de S100A12, que quelates nutrientes de zinc, por lo tanto hambrientos H. pylori que requiere zinc para el crecimiento y pRoliferation.
Introduction
Las proteínas S100 son una clase de la familia EF-mano de proteínas vinculantes de calcio con una amplia gama de funciones [ 1] . Se expresan de una manera específica de tejidos y células, y regulan un amplio espectro de funciones celulares 2 , 3 . Únicas a las proteínas de unión al calcio, las proteínas S100 exhiben funciones intracelulares y extracelulares 4 , 5 . Dentro de la célula, Ca 2 + vinculante induce un cambio conformacional que expone una superficie hidrófoba que se dirige específicamente a los socios de unión a proteínas [ 6] . Este mecanismo intracelular regula importantes procesos como la proliferación celular, la diferenciación y el metabolismo energético. En el medio extracelular, S100 proteínas presentan dos funciones [ 7] . En uno, actúan como patrón molecular asociado al daño (DAMP) e inician una inflamación pro-inflamatoriaRespuesta inmune a través de la interacción con el patrón de reconocimiento de los receptores [ 8 , 9] . Además, varios miembros de la clase de proteína S100 secuestran metales de transición, una función que sirve para matar de hambre a los patógenos microbianos en un proceso denominado inmunidad nutricional 10 , 11 .
El S100A12 (también conocido como calgranulina C y EN-RAGE) está altamente expresado en macrófagos y neutrófilos y ha sido identificado como un biomarcador potencial para enfermedades inflamatorias 12 , 13 . Además de fijar calcio en sus sitios EF-Hand, S100A12 tiene dos sitios de unión de metal de transición de alta afinidad situados en extremos opuestos de la interfaz 14 , 15 de dímero. Cada sitio de unión está compuesto por tres residuos de histidina y un residuo de ácido aspártico y puede quelar zinc o cobre <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Recientemente, se informó de que S100A12 dependientes de cinc hambre es importante en la regulación Helicobacter pylori crecimiento y la actividad de los factores de virulencia pro-inflamatoria [ 18] .
H. pylori infecta el estómago de aproximadamente la mitad de la población humana del mundo; Por lo que sin duda uno de los más exitosos patógenos bacterianos [ 19] . La infección con H. pylori puede conducir a resultados significativos de la enfermedad gástrica incluyendo gastritis, úlcera péptica y duodenal, linfoma linfoide asociado con mucosa (MALT) y adenocarcinoma gástrico invasivo (cáncer de estómago). El cáncer de estómago es la principal causa de muerte asociada al cáncer no cardiaco en el mundo, y el factor de riesgo asociado más grande para el cáncer de estómago es la infección por H. pylori .
H. pylori persiste en el nicho gástrico a pesar de un robuSt respuesta inmune al patógeno, lo que subraya la necesidad de una mejor comprensión de los mecanismos inmunes de control de esta infección bacteriana [ 20 , 21 , 22 , 23] . La inflamación asociada a H. pylori se caracteriza por una profunda infiltración de células polimorfonucleares, o neutrófilos, que depositan un repertorio de proteínas antimicrobianas, incluyendo S100A12, en el sitio de infección 18 , 24 , 25 . En un esfuerzo por entender el complejo diálogo entre el huésped y el patógeno, buscamos refinar la técnica para purificar S100A12 y usarla para estudiar el efecto antimicrobiano que ejerce sobre este patógeno relevante desde el punto de vista médico. El protocolo siguiente describe una técnica mejorada para la purificación de S100A12 en su estado biológicamente activo; Capaz de unir metales nutrientes con alto affiniY la quelación de los microorganismos invasores. Además, los métodos a continuación destacan la utilidad de esta proteína como un reactivo crítico para estudiar el mecanismo por el cual las moléculas antimicrobianas innatas restringen el crecimiento de patógenos bacterianos.
Las proteínas de la familia S100A han ganado reconocimiento como un importante grupo de moléculas del sistema inmune innatas que participan en la señalización inmunológica así como en la defensa del huésped 27 . El más bien estudiado de estos es calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . La calprotectina es una proteína asociada a los neutrófilos que forma un heterodímero de las subunidades S100A8 y S100A9 que se une a los metales de transición en la interfaz dímero [ 31] . Se ha demostrado que la calprotectina posee dos sitios de unión de metal: el sitio 1 puede unirse a Zn 2+ , Mn 2+ o Fe 2+ , y el sitio 2 puede Se unen Zn ^ { 2+} 31 , 32 . Numerosos informes han demostrado que la calprotectina tiene actividades antimicrobianas contra diversos patógenos, incluyendo Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli y H. pylori , y que los efectos inhibidores se deben a la actividad de quelación del metal de calprotectina 25 , 28 , 29 .
Trabajos previos demostraron que la calprotectina ejerce numerosas actividades sobre H. pylori, incluyendo la alteración de la estructura de los lípidos A en la membrana externa, reprimiendo el sistema de secreción cag- Tipo IV (que es un factor de virulencia proinflamatorio mayor en H. pylori ), induciendo la formación de biofilm y reprimiendo Crecimiento y viabilidad de H. pylori de una manera dependiente de la dosisClass = "xref"> 25 , 33 . Además, los ensayos genéticos y bioquímicos revelaron que la actividad antibacteriana de la calprotectina contra H. pylori se derivaba en gran medida de su capacidad para unirse al nutriente de zinc [ 25] . H. pylori requiere zinc, como se determinó mediante investigaciones previas que utilizaron un medio químicamente definido para determinar los requerimientos de micronutrientes para que este patógeno crezca y prolifere 34 . Además, la calprotectina era muy abundante dentro de los tejidos infectados por H. pylori , y asociada con infiltrados neutrófilos, lo que indica que el huésped puede emplear calprotectina como una estrategia antimicrobiana durante la infección y la posterior inflamación 25 , 35 .
La evidencia reciente de las técnicas de detección de la proteómica imparcial sugiere que bajo condiciones donde las especies reactivas del oxígeno son abundantes, calprotecEl estaño experimenta modificaciones postraduccionales que alteran el sitio de unión de hexa-histidina, inhibiendo así la actividad de unión a metal de la proteína 36 . Como tal, la hipótesis de que otras proteínas de la familia S100A entre el amplio repertorio de estas moléculas podrían actuar potencialmente como metal-quelantes auxiliares. Se seleccionó S100A12 para su posterior estudio debido a que no se identificó en la pantalla antes mencionada para modificación post-traduccional, tiene la capacidad de unir zinc y es muy abundante en tejidos humanos derivados de H. pylori .
Nuestro trabajo indica que S100A12 puede inhibir el crecimiento y la viabilidad de H. pylori de una manera dependiente de la dosis en la cepa G27 de H. pylori , y que la actividad antimicrobiana de esta proteína puede ser revertida por la adición de exceso de nutrientes de zinc. Este trabajo complementa nuestro trabajo anterior indicando S100A12 ejerció actividad antimicrobiana contra PMSS1 y 7.13 cepas de H. pylori , lo que demuestra su amplia actividad antibacteriana contra numerosos aislamientos clínicos y adaptado a laboratorio cepas de H. pylori [ 18] . En conjunto, estos resultados confirman la importancia de S100A12 como un mecanismo para controlar el crecimiento bacteriano y la proliferación a través de la inmunidad nutricional. Futuros estudios de esta importante interacción huésped-bacteriana podrían incluir explotar la actividad de S100A12 para reducir la carga bacteriana en los tejidos del huésped o determinar la contribución de esta proteína a la señalización inmune en el contexto de la infección por H. pylori .
Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un protocolo eficaz tanto para la expresión como para la purificación de S100A12 humano. El sistema de expresión de E. coli es la herramienta más común usada para la producción de proteínas recombinantes, particularmente cuando se requieren cantidades de mg para estudios bioquímicos y biofísicos. Una mejora clave del procedimiento descrito aquí es el uso de medios de autoinducción 26 que aumenta el rendimiento de proteína purificada por un factor de casi treinta e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta investigación fue apoyada por el Departamento de Asuntos de Veteranos Premio de Desarrollo de Carrera 1IK2BX001701, CTSA premio UL1TR000445 del Centro Nacional para el Avance Translational Sciences, la Fundación Nacional de Ciencias Premio Números 1547757 y 1400969, y el NIH concesión GM05551. Su contenido es exclusivamente responsabilidad de los autores y no necesariamente representan puntos de vista oficiales del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Translacionales o los Institutos Nacionales de Salud.
Materials
| S100A12 Expression | ||
| Expression cells | ||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 |
| Autoinduction medium components | ||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 |
| Selection agent | ||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 |
| S100A12 Purification | ||
| AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 |
| Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 |
| H. pylori Culture | ||
| Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 |
| Cholesterol (250X) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
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