Expression, Reinigung und antimikrobielle Aktivität von S100A12
Summary
Hier stellen wir eine Methode zur Expression und Reinigung von S100A12 (Calgranulin C) vor. Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung seiner antimikrobiellen Aktivität gegen den menschlichen Pathogen H. pylori .
Abstract
Calgranulin-Proteine sind wichtige Mediatoren der angeborenen Immunität und sind Mitglieder der S100-Klasse der EF-Hand-Familie von Calcium-bindenden Proteinen. Einige S100-Proteine haben die Fähigkeit, Übergangsmetalle mit hoher Affinität zu binden und sie effektiv von eindringenden mikrobiellen Pathogenen in einem Prozess abzuscheiden, der als "ernährungsbedingte Immunität" bezeichnet wird. S100A12 (EN-RAGE) bindet sowohl Zink als auch Kupfer und ist in angeborenen Immunzellen wie Makrophagen und Neutrophilen sehr reichlich vorhanden. Wir berichten über eine verfeinerte Methode für die Expression, Anreicherung und Reinigung von S100A12 in ihrer aktiven, metallbindenden Konfiguration. Die Verwendung dieses Proteins in Bakterienwachstums- und Lebensfähigkeitsanalysen zeigt, dass S100A12 eine antimikrobielle Wirkung gegen den bakteriellen Pathogen, Helicobacter pylori, aufweist . Die antimikrobielle Aktivität beruht auf der Zinkbindungsaktivität von S100A12, die Nährstoffzink chelatisiert und dadurch H. pylori verhungert, was Zink für Wachstum und p erfordertRolltation
Introduction
S100-Proteine sind eine Klasse der EF-Hand-Familie von Calcium-bindenden Proteinen mit einer Vielzahl von Funktionen 1 . Sie werden in einer gewebe- und zellspezifischen Weise exprimiert und regeln ein breites Spektrum an zellulären Funktionen 2 , 3 . Einzigartige Calcium-bindende Proteine, S100-Proteine zeigen sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Funktionen 4 , 5 . Innerhalb der Zelle induziert die Ca 2+ -Bindung eine Konformationsänderung, die eine hydrophobe Oberfläche aussetzt, die spezifisch auf Proteinbindungspartner 6 abzielt. Dieser intrazelluläre Mechanismus reguliert wichtige Prozesse wie Zellproliferation, Differenzierung und Energiestoffwechsel. Im extrazellulären Milieu zeigen S100-Proteine zwei Funktionen 7 . In einem, sie fungieren als Schmerz assoziierte molekulare Muster (DAMP) Proteine und initiieren einen Pro-inflammAtory Immunantwort durch Interaktion mit Mustererkennungsrezeptoren 8 , 9 . Zusätzlich sind mehrere Mitglieder der S100-Protein-Klassen-Sequester-Übergangsmetalle, eine Funktion, die dazu dient, mikrobielle Pathogene in einem Prozess zu verhungern, der als Ernährungsstörung 10 , 11 bezeichnet wird .
S100A12 (auch bekannt als Calgranulin C und EN-RAGE) wird in Makrophagen und Neutrophilen stark exprimiert und als potentieller Biomarker für entzündliche Erkrankungen identifiziert 12 , 13 . Zusätzlich zu dem Binden von Calcium an seinen EF-Hand-Stellen hat S100A12 zwei hochaffine Übergangsmetall-Bindungsstellen, die sich an gegenüberliegenden Enden der Dimer-Grenzfläche 14 , 15 befinden . Jede Bindungsstelle besteht aus drei Histidinresten und einem Asparaginsäurerest und kann Zink oder Kupfer chelatierenSup class = "xref"> 16 , 17 . In letzter Zeit haben wir berichtet, dass S100A12-abhängiger Zink-Hunger bei der Regulierung des Helicobacter pylori -Wachstums und der Aktivität der entzündlichen Virulenzfaktoren wichtig ist.
H. pylori infiziert den Magen von etwa der Hälfte der menschlichen Bevölkerung der Welt; Es ist wohl einer der erfolgreichsten bakteriellen Pathogene 19 . Infektion mit H. pylori kann zu signifikanten Magen-Krankheit Ergebnisse einschließlich Gastritis, Magen-und Zwölffingerdarm-Geschwür, Schleimhaut assoziierten lymphatischen Gewebe (MALT) Lymphom und invasiven Magen-Adenokarzinom (Magenkrebs) führen. Magenkrebs ist die führende Ursache für Nicht-Cardia-Krebs-assoziierten Tod in der Welt, und der einzige größte assoziierte Risikofaktor für Magenkrebs ist Infektion mit H. pylori .
H. pylori bleibt in der Magen-Nische trotz einer robuEine Immunantwort auf den Erreger und unterstreicht die Notwendigkeit eines besseren Verständnisses von Immunmechanismen zur Bekämpfung dieser bakteriellen Infektion 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori- assoziierte Entzündungen zeichnen sich durch eine tiefe Infiltration von polymorphonuklearen Zellen oder Neutrophilen aus, die ein Repertoire antimikrobieller Proteine, einschließlich S100A12, an der Stelle der Infektion 18 , 24 , 25 ablagern. In dem Bemühen, den komplexen Dialog zwischen Host und Pathogen zu verstehen, suchten wir die Technik zu verfeinern, um S100A12 zu reinigen und es zu verwenden, um die antimikrobielle Wirkung zu untersuchen, die sie auf diesen medizinisch relevanten Erreger ausübt. Das Protokoll unten beschreibt eine verbesserte Technik für die S100A12-Reinigung in ihrem biologisch aktiven Zustand; Fähig, Nährstoffmetalle mit hohem Affini zu bindenTy und chelatisieren sie weg von eindringenden Mikroorganismen. Darüber hinaus unterstreichen die nachstehenden Methoden die Nützlichkeit dieses Proteins als kritisches Reagenz, um den Mechanismus zu untersuchen, durch den angeborene antimikrobielle Moleküle das Wachstum von bakteriellen Pathogenen einschränken.
S100A-Familie Proteine haben Anerkennung als eine wichtige Gruppe von angeborenen Immunsystem Moleküle gewonnen, die an der Immunsignalisierung sowie Host Verteidigung teilnehmen 27 . Das am meisten untersuchte ist Calprotectin (MRP-8/14, Calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin ist ein Neutrophil-assoziiertes Protein, das ein Heterodimer der S100A8- und S100A9-Untereinheiten bildet, die Übergangsmetalle an der Dimer-Grenzfläche 31 bindet. Es wurde gezeigt, dass Calprotektin zwei Metallbindungsstellen besitzt: Standort 1 kann Zn 2+ , Mn 2+ oder Fe 2+ binden und Standort 2 können Binden Zn 2+ 31 , 32 . Zahlreiche Berichte haben gezeigt, dass Calprotektin antimikrobielle Aktivitäten gegen verschiedene Pathogene wie Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli und H. pylori aufweist und dass die hemmenden Wirkungen auf die Metallchelataktivität von Calprotectin 25 , 28 zurückzuführen sind , 29 .
Bisherige Arbeiten zeigten, dass Calprotektin zahlreiche Aktivitäten auf H. pylori ausübt, einschließlich der Veränderung der Lipid-A-Struktur in der äußeren Membran und unterdrückt das Cag-Typ IV-Sekretionssystem (das ein wichtiger proinflammatorischer Virulenzfaktor innerhalb von H. pylori ist ), wodurch die Biofilmbildung und die Unterdrückung induziert wird H. pylori Wachstum und Lebensfähigkeit in einer dosisabhängigen WeiseClass = "xref"> 25 , 33 . Darüber hinaus zeigten genetische und biochemische Assays die antibakterielle Aktivität von Calprotectin gegen H. pylori wurde weitgehend aus seiner Fähigkeit, Nährstoff Zink 25 zu binden abgeleitet. H. pylori erfordert Zink, wie es bei früheren Untersuchungen bestimmt wurde, die ein chemisch definiertes Medium nutzten, um die Mikronährstoffanforderungen für dieses Pathogen zu ermitteln, um zu wachsen und zu vermehren 34 . Zusätzlich war Calprotectin in H. pylori- infizierten Geweben sehr reichlich vorhanden und mit neutrophilen Infiltraten assoziiert, was anzeigt, dass der Wirt Calprotektin als antimikrobielle Strategie während der Infektion und nachfolgende Entzündung 25 , 35 einsetzen kann .
Der jüngste Beweis von den unvoreingenommenen Proteomik-Screening-Techniken deutet darauf hin, dass unter Bedingungen, bei denen reaktive Sauerstoffspezies reichlich vorhanden sind, calprotecZinn unterliegt posttranslationalen Modifikationen, die die Hexa-Histidin-Bindungsstelle verändern und dadurch die Metallbindungsaktivität des Proteins 36 hemmen. Als solches haben wir vermutet, dass andere S100A-Familienproteine unter dem breiten Repertoire dieser Moleküle potentiell als Hilfsmetall-Chelatoren wirken könnten. Wir haben S100A12 für eine weitere Studie ausgewählt, weil es in dem oben erwähnten Screen für die posttranslationale Modifikation nicht identifiziert wurde, es hat die Fähigkeit, Zink zu binden, und es ist sehr reich an menschlichen Geweben, die von H. pylori- infizierten Individuen stammen.
Unsere Arbeit zeigt, dass S100A12 H. pylori Wachstum und Lebensfähigkeit in einer dosisabhängigen Weise im G27-Stamm von H. pylori hemmen kann und dass die antimikrobielle Aktivität dieses Proteins durch die Zugabe von überschüssigem Nährstoff-Zink umgekehrt werden kann. Diese Arbeit ergänzt unsere bisherige Arbeit, die darauf hinweist, dass S100A12 antimikrobielle Aktivität gegen PMSS1 und 7.1 ausübt3-Stämme von H. pylori , die ihre breite antibakterielle Wirkung gegen zahlreiche klinische Isolate und Labor-adaptierte Stämme von H. pylori 18 zeigen . Gemeinsam bestätigen diese Ergebnisse die Bedeutung von S100A12 als Mechanismus zur Kontrolle des Bakterienwachstums und der Proliferation durch Ernährungsunempfindlichkeit. Zukünftige Untersuchungen dieser wichtigen Wirtsbakterien-Interaktion könnten die Ausnutzung der Aktivität von S100A12 zur Verringerung der Bakterienbelastung innerhalb von Wirtsgeweben oder die Bestimmung des Beitrags dieses Proteins zur Immunsignalisierung im Kontext der H. pylori- Infektion umfassen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es wird ein effizientes Protokoll für die Expression und Reinigung von humanem S100A12 vorgestellt. Das E. coli- Expressionssystem ist das häufigste Mittel, das für die Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet wird, insbesondere wenn mg-Mengen für biochemische und biophysikalische Studien erforderlich sind. Eine Schlüsselverbesserung des hier beschriebenen Verfahrens ist die Verwendung von Autoinduktionsmedien 26 , die die Ausbeute an gereinigtem Protein um einen Faktor von…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von der Abteilung für Veteranen Angelegenheiten Karriere Entwicklung Award 1IK2BX001701, CTSA Award UL1TR000445 aus dem National Center for Advancing Translational Sciences, die National Science Foundation Award Nummern 1547757 und 1400969 und NIH Grant GM05551 unterstützt. Ihr Inhalt liegt allein in der Verantwortung der Autoren und stellt nicht unbedingt offizielle Ansichten des Nationalen Zentrums für die Förderung der Translationswissenschaften oder der National Institutes of Health dar.
Materials
| S100A12 Expression | ||
| Expression cells | ||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 |
| Autoinduction medium components | ||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 |
| Selection agent | ||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 |
| S100A12 Purification | ||
| AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 |
| Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 |
| H. pylori Culture | ||
| Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 |
| Cholesterol (250X) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
References
- Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
- Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).
- Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).
- Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
- Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).
- Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).
- Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).
- Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
- Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).
- Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).
- Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).
- Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).
- Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).
- Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).
- Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).
- Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).
- Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).
- de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).
- Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).
- Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).
- Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
- Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).
- Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).
- Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).
- Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).
- Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
- Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).
- Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).
