S100A12'nin Ekspresyon, Saflaştırma ve Antimikrobiyal Aktivitesi
Summary
Burada, S100A12'yi (calgranulin C) ifade etmek ve saflaştırmak için bir yöntem sunuyoruz. İnsan patojen H. pylori'ye karşı antimikrobiyal aktivitesini ölçmek için bir protokolü açıklıyoruz.
Abstract
Calgranulin proteinleri doğal bağışıklığın önemli aracılarıdır ve EF el ailesinin kalsiyum bağlayıcı proteinlerin S100 sınıfının üyesidir. Bazı S100 proteinleri, geçiş metallerini yüksek afinite ile bağlama kapasitesine sahiptir ve bunları, "beslenme bağışıklığı" olarak adlandırılan bir süreçte mikrobiyal patojenlere işgal etmekten alıkoyar. S100A12 (EN-RAGE), hem çinko hem de bakırı bağlar ve makrofajlar ve nötrofiller gibi doğal immün hücrelerde oldukça bol miktarda bulunur. S100A12'nin aktif, metal bağlayıcı konfigürasyonunda ekspresyon, zenginleştirme ve saflaştırma için rafine edilmiş bir metodu sunuyoruz. Bakteriyel büyüme ve canlılık analizlerinde bu proteinin kullanılması, S100A12'nin bakteri patojeni Helicobacter pylori'ye karşı antimikrobiyal etkinliğe sahip olduğunu ortaya koymaktadır . Antimikrobiyal aktivite, besleyici çinkoyu kenetleyen S100A12'nin çinko bağlanma aktivitesine dayandığından, büyüme için çinko gerektiren H.pylori'yi açlıktan besler ve proliferation.
Introduction
S100 proteinleri, çeşitli fonksiyon dizisine sahip 1 EF-el ailesi kalsiyum bağlayıcı proteinlerin bir sınıfıdır. Bunlar doku ve hücreye spesifik bir şekilde ifade edilir ve geniş bir hücre fonksiyonları yelpazesini 2 , 3 düzenler. Kalsiyum bağlayıcı proteinlere özgü olan S100 proteinleri hem hücre içi hem de hücre dışı işlevleri gösterirler 4 , 5 . Hücre içinde, Ca 2 + bağlanması özellikle protein bağlama ortakları 6 hedefleyen bir hidrofobik yüzey ortaya bir yapısal değişiklik indüklenir. Bu hücre içi mekanizma hücre proliferasyonu, farklılaşma ve enerji metabolizması gibi önemli süreçleri düzenler. Ekstraselüler çevrede, S100 proteinleri iki işlev sergilemektedir 7 . Birinde, moleküler model (DAMP) proteinlerine hasar gibi davranırlar ve bir pro-inflammayı başlatırlarKalıp tanıma reseptörleri 8 , 9 ile etkileşim yoluyla bağışıklık cevabını ileri sürmek. Ek olarak, S100 protein sınıfının birkaç üyesi, geçiş metallerini, besleyici bağışıklık 10 , 11 olarak adlandırılan bir süreçte mikrobik patojenlere aç bırakmaya hizmet eden bir işlevi saklar.
S100A12 (aynı zamanda calgranulin C ve EN-RAGE olarak da bilinir), makrofajlar ve nötrofillerde yüksek oranda eksprese edilir ve inflamatuar hastalıklar için potansiyel bir biyolojik belirteç olarak tanımlanmıştır 12,13. EF-Hand bölgelerinde kalsiyumu bağlamaya ek olarak, S100A12 dimer arayüzünün 14 , 15 karşı uçlarında bulunan iki yüksek afiniteli geçiş metali bağlama mevkisine sahiptir. Her bir bağlanma yeri, üç histidin kalıntısı ve bir aspartik asit kalıntısı içerir ve çinko veya bakır <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Yakın zamanda, S100A12'ye bağımlı çinko açlığın, Helicobacter pylori büyümesini ve pro-inflamatuar virulans faktörlerinin aktivitesini düzenleyen önemli olduğunu bildirdik.
H. pylori , dünyadaki insan nüfusunun yaklaşık yarısının karnını enfekte eder; Bunu en başarılı bakteriyel patojenlerden biri haline getirir 19 . H. pylori ile enfeksiyon gastrit, peptik ve duodenal ülser, mukoza ilişkili lenfoid doku (MALT) lenfoma ve invaziv gastrik adenokarsinoma (mide kanseri) gibi önemli gastrik hastalık sonuçlarına yol açabilir. Karaciğer kanseri, dünyada kardiyovasküler kansere bağlı ölümlerin önde gelen sebebidir ve mide kanseri için tek büyük ilişkili risk faktörü H. pylori ile enfeksidir.
H. pylori , gevrek olmasına rağmen mide nişinde devam ederBu bakteriyel enfeksiyonu kontrol altına almak için bağışıklık mekanizmalarının daha iyi anlaşılmasına ihtiyaç olduğunu vurguladı. H. pylori'ye bağlı inflamasyon, enfeksiyon yeri 18 , 24 , 25'de S100A12 de dahil olmak üzere antimikrobiyal proteinlerin bir repertuarını depolayan polimorfonükleer hücrelerin veya nötrofillerin derin infiltrasyonu ile karakterizedir. Ev sahibi ve patojen arasındaki karmaşık diyalogu anlamak için, S100A12'yi saflaştırma tekniğini hassaslaştırmaya ve bu tıbbi açıdan ilgili patojene uyguladığı antimikrobiyal etkiyi incelemek için kullanmaya çalıştık. Aşağıdaki protokol, biyolojik açıdan aktif durumda S100A12 saflaştırması için geliştirilmiş bir tekniğin özetini vermektedir; Besleyici metalleri yüksek oranda bağlayabilenBunları işgal altındaki mikroorganizmalara toplayıp onları şelale haline getirin. Ayrıca, aşağıdaki yöntemler, bu proteinin, doğuştan gelen antimikrobiyal moleküllerin bakteriyel patojenlerin büyümesini sınırlandırdığı mekanizmayı incelemek için kritik bir reaktif olarak kullanılmasını vurgulamaktadır.
S100A ailesindeki proteinler, konak savunmasının yanı sıra bağışıklık sinyalizasyonuna katılan doğal bir bağışıklık sistemi molekülünün önemli bir parçası olarak takdir kazanmışlardır. Bunların en iyi çalışılanı kalprotektindir (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . Calprotectin, dimer ara yüz 31'de geçiş metallerini bağlayan S100A8 ve S100A9 alt birimlerinin bir heterodimeri oluşturan nötrofile bağlı bir proteindir. Calprotectin'in iki metal bağlama sahasına sahip olduğu gösterilmiştir: Site 1, Zn 2+ , Mn 2+ veya Fe 2+ 'yi bağlayabilir ve Site 2, Zn 2+ 31 , 32'yi bağlayın . Calprotectinin, Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli ve H. pylori gibi çeşitli patojenlere karşı antimikrobiyal etkinlik gösterdiğini ve önleyici etkilerin calprotectin 25 , 28'in metal şelasyon aktivitesinden kaynaklandığını gösteren çok sayıda rapor var. , 29 .
Calprotectin, dış membrandaki lipit A yapısının değiştirilmesi, cag -Type IV salgılama sisteminin ( H. pylori içinde önemli bir proenflamatuar virulans faktörüdür) bastırılması, biyofilm oluşumuna neden olması ve bastırılması da dahil olmak üzere H. pylori üzerinde çok sayıda etkinlik sergilediğini gösterdi H. pylori büyümesi ve canlı dozu doza bağımlı bir şekildeClass = "xref"> 25 , 33 . Dahası, genetik ve biyokimyasal analizler, H. pylori'ye karşı calprotectin'in antibakteriyel etkisinin büyük oranda besleyici çinkoyu 25 bağlama yeteneğinden kaynaklandığını ortaya koymuştur. H. pylori , bu patojenin büyümesi ve çoğalması için mikrobesin gereksinimlerini belirlemek için kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam kullanan önceki araştırmalar tarafından belirlendiği üzere çinko gerektirir 34 . Buna ek olarak, kalprote- tein, H. pylori ile enfekte dokular içinde oldukça miktarda bulunur ve nötrofilik infiltratlarla ilişkili olup, konakçıya enfeksiyondan sonra inflamasyon sırasında kalprotektini antimikrobiyal bir strateji olarak kul- lanılabilir.
Yansız proteomik tarama tekniklerinden elde edilen son bulgular, reaktif oksijen türlerinin bol olduğu koşullar altında, kalprotecKalay, hekza-histidin bağlanma yerini değiştiren, dolayısıyla proteinin metal bağlanma aktivitesini inhibe eden translasyon sonrası modifikasyonları gerçekleştirir 36 . Bu nedenle, bu moleküllerin geniş repertuarındaki diğer S100A ailesindeki proteinlerin potansiyel olarak yardımcı metal-kıskaçlayıcılar olarak işlev görebileceğini varsaydık. Daha sonraki çalışma için S100A12'yi seçtik çünkü söz konusu translasyon sonrası modifikasyon ekranı üzerinde tanımlanmadı, çinkoyu bağlama kapasitesine sahipti ve H. pylori ile enfekte olmuş kişilerden türetilen insan dokularında oldukça bol miktarda bulunur.
Çalışmalarımız, S100A12'nin, H. pylori'nin G27 suşunda H. pylori büyümesini ve yaşayabilirliğini doza bağımlı bir şekilde inhibe edebildiğini ve bu proteinin antimikrobiyal aktivitesinin fazla besleyici çinko ilavesiyle tersine çevrilebileceğini gösteriyor. Bu çalışma, S100A12'nin PMSS1 ve 7.1'e karşı antimikrobiyal etkinlik gösterdiğini gösteren önceki çalışmamızı tamamlamaktadır3 suşu H. pylori , sayısız klinik izolelere ve laboratuara uyarlanmış H. pylori suşlarına karşı geniş antibakteriyel etkisini göstermektedir. Birlikte, bu sonuçlar S100A12'nin besleyici bağışıklık yoluyla bakteri gelişimini ve proliferasyonunu kontrol eden bir mekanizma olarak önemini teyit eder. Bu önemli konak-bakteriyel etkileşimin gelecekteki çalışmaları arasında, konukçu dokulardaki bakteri yükünü azaltmak veya H. pylori enfeksiyonu bağlamında bu proteinin bağışıklık sinyalizasyonuna katkısını belirlemek için S100A12 aktivitesini kullanmak yer alabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
İnsan S100A12'nin ekspresyonu ve saflaştırılması için etkili bir protokol sunulmuştur. E. coli ekspresyon sistemi, özellikle biyokimyasal ve biyofiziksel çalışmalar için mg miktarları gerektiğinde rekombinant proteinlerin üretimi için kullanılan en yaygın araçtır. Burada tarif edilen prosedürün anahtar geliştirilmesi, standart Luria besiyeri ortamı 18 ile ekspresyona kıyasla saflaştırılmış proteinin verimini neredeyse otuz kadar arttıran otomatik endük…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Gaziler İşleri Kariyer Geliştirme Ödülü 1IK2BX001701, Ulusal Bilimsel Araştırma Vakfı İleri Düzeyde Ulusal Merkezi'nden CTSA ödülü UL1TR000445, Ulusal Bilim Kurumu Ödül Numaraları 1547757 ve 1400969 ve NIH hibe GM05551 tarafından desteklendi. İçeriği yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Transaksiyonel Bilimler Geliştirme Ulusal Merkezi veya Ulusal Sağlık Enstitüleri'nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir.
Materials
| S100A12 Expression | ||
| Expression cells | ||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 |
| Autoinduction medium components | ||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 |
| Selection agent | ||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 |
| S100A12 Purification | ||
| AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 |
| Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 |
| H. pylori Culture | ||
| Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 |
| Cholesterol (250X) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
References
- Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
- Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).
- Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).
- Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
- Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).
- Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).
- Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).
- Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
- Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).
- Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).
- Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).
- Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).
- Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).
- Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).
- Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).
- Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).
- Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).
- Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).
- de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).
- Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).
- Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).
- Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
- Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).
- Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
- Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).
- Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).
- Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).
- Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).
- Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
- Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).
- Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).
