Summary

Expressão, Purificação e Actividade Antimicrobiana de S100A12

Published: May 13, 2017
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Summary

Aqui, apresentamos um método para expressar e purificar S100A12 (calgranulina C). Descrevemos um protocolo para medir sua atividade antimicrobiana contra o patógeno humano H. pylori .

Abstract

As proteínas de calgranulina são mediadores importantes da imunidade inata e são membros da classe S100 da família EF-mão de proteínas de ligação de cálcio. Algumas proteínas S100 têm a capacidade de se ligar a metais de transição com alta afinidade e efetivamente seqüestrar eles longe de patógenos microbianos invasores em um processo que é denominado "imunidade nutricional". O S100A12 (EN-RAGE) liga tanto o zinco como o cobre e é altamente abundante em células imunes inatas tais como macrófagos e neutrófilos. Relatamos um método refinado para a expressão, enriquecimento e purificação de S100A12 na sua configuração ativa de ligação a metais. A utilização desta proteína em análises de crescimento e viabilidade bacteriana revela que S100A12 tem actividade antimicrobiana contra o patogénio bacteriano Helicobacter pylori . A actividade antimicrobiana baseia-se na actividade de ligação ao zinco de S100A12, que quela o zinco nutriente, privando assim H. pylori que requer zinco para crescimento e pRoliferation.

Introduction

As prote�as S100 s� uma classe da fam�ia EF-hand de prote�as de liga�o de c�cio com uma diversidade de fun�es 1 . Eles são expressos de uma forma específica de tecidos e células, e regulam um amplo espectro de funções celulares 2 , 3 . Exclusivas para proteínas de ligação ao cálcio, as proteínas S100 exibem funções intracelulares e extracelulares 4 , 5 . Dentro da célula, a ligação de Ca2 + induz uma alteração conformacional que expõe uma superfície hidrofóbica que alveja especificamente parceiros de ligação à proteína 6 . Este mecanismo intracelular regula processos importantes como proliferação celular, diferenciação e metabolismo energético. No meio extracelular, as proteínas S100 exibem duas funções 7 . Num deles, actuam como proteínas associadas a padrões moleculares associados (DAMP) e iniciam uma pró-inflamaçãoResposta imune atórica através da interação com receptores de reconhecimento de padrão 8 , 9 . Além disso, vários membros da classe de proteínas S100 sequestam metais de transição, uma função que serve para privar patógenos microbianos em um processo denominado imunidade nutricional 10 , 11 .

S100A12 (também conhecida como calgranulina C e EN-RAGE) é altamente expressa em macrófagos e neutrófilos e tem sido identificada como potencial biomarcador para doenças inflamatórias 12,13 . Além de ligar o cálcio nos seus locais EF-Hand, S100A12 tem dois locais de ligação de metais de transição de alta afinidade localizados em extremidades opostas da interface dimérica 14 , 15 . Cada sítio de ligação é constituído por três resíduos de histidina e um resíduo de ácido aspártico e pode quelar zinco ou cobre <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Recentemente, relatamos que a fome de zinco dependente de S100A12 é importante na regulação do crescimento de Helicobacter pylori e da atividade de fatores de virulência pró-inflamatórios 18 .

H. pylori infecta o estômago de cerca de metade da população humana do mundo; Tornando-se sem dúvida um dos mais bem sucedidos patógenos bacterianos [ 19] . A infecção com H. pylori pode levar a resultados significativos da doença gástrica incluindo gastrite, úlcera péptica e duodenal, linfoma de tecido linfóide associado à mucosa (MALT) e adenocarcinoma gástrico invasivo (câncer de estômago). O câncer de estômago é a principal causa de morte associada ao câncer de não-cardia no mundo, eo maior fator de risco associado para câncer de estômago é a infecção por H. pylori .

H. pylori persiste no nicho gástrico apesar de um robuSt resposta imune ao patógeno, sublinhando a necessidade de uma melhor compreensão dos mecanismos imunes de controle desta infecção bacteriana 20 , 21 , 22 , 23 . A inflamação associada ao H. pylori é caracterizada por uma profunda infiltração de células polimorfonucleares, ou neutrófilos, que depositam um repertório de proteínas antimicrobianas, incluindo S100A12, no local da infecção 18 , 24 , 25 . Em um esforço para entender o complexo diálogo entre hospedeiro e patógeno, buscamos refinar a técnica para purificar S100A12 e usá-lo para estudar o efeito antimicrobiano que exerce sobre este patógeno clinicamente relevante. O protocolo abaixo descreve uma técnica melhorada para a purificação de S100A12 no seu estado biologicamente activo; Capazes de se ligar a metais nutrientes com altaE eliminando-os de microrganismos invasores. Além disso, os métodos abaixo destacam a utilidade desta proteína como um reagente crítico para estudar o mecanismo pelo qual as moléculas antimicrobianas inatas restringem o crescimento de patógenos bacterianos.

As proteínas da família S100A ganharam apreciação como um importante grupo de moléculas do sistema imune inatas que participam na sinalização imune bem como na defesa do hospedeiro 27 . O mais bem estudado destes é a calprotectina (MRP-8/14, calgranulina A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . A calprotectina é uma proteína associada a neutrófilos que forma um heterodímero das subunidades S100A8 e S100A9 que liga metais de transição na interface dímero 31 . Verificou-se que a calprotectina possui dois locais de ligação de metal: o local 1 pode ligar Zn2 + , Mn2 + ou Fe2 + e o sítio 2 pode Se Zn2 + 31 , 32 . Numerosos relatos demonstraram que a calprotectina tem atividades antimicrobianas contra diversos agentes patogênicos incluindo Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli e H. pylori e que os efeitos inibitórios são devidos à atividade de quelação de metal da calprotectina 25,28 , 29 .

Trabalhos anteriores demonstraram que a calprotectina exerce numerosas atividades sobre H. pylori, incluindo a alteração da estrutura do lípido A na membrana externa, reprimindo o sistema de secreção tipo IV (que é um importante fator de virulência proinflamatório dentro de H. pylori ), induzindo a formação de biofilme e reprimindo Crescimento e viabilidade de H. pylori de uma forma dependente da doseClass = "xref"> 25 , 33 . Além disso, os ensaios genéticos e bioquímicos revelaram que a actividade antibacteriana da calprotectina contra H. pylori foi largamente derivada da sua capacidade para ligar o zinco nutriente 25 . H. pylori requer zinco, como foi determinado por pesquisas anteriores, que utilizou um meio quimicamente definido para determinar os requisitos de micronutrientes para este patógeno para crescer e proliferar [ 34] . Além disso, a calprotectina foi altamente abundante nos tecidos infectados com H. pylori e associada a infiltrados neutrófilos, indicando que o hospedeiro pode empregar calprotectina como estratégia antimicrobiana durante a infecção e subseqüente inflamação 25,35.

Evidências recentes de técnicas de triagem proteômica não-direcionadas sugerem que sob condições onde espécies reativas de oxigênio são abundantes, calprotecO estanho sofre modificações pós-translacionais que alteram o local de ligação da hexa-histidina, inibindo assim a actividade de ligação do metal da proteína 36 . Como tal, nós hipotetizamos que outras proteínas da família S100A entre o vasto repertório dessas moléculas poderiam potencialmente atuar como quelantes metálicos auxiliares. Seleccionou-se S100A12 para estudo adicional porque não foi identificado no referido ecrã para modificação pós-tradução, tem a capacidade de ligar o zinco e é altamente abundante em tecidos humanos derivados de indivíduos infectados com H. pylori .

O nosso trabalho indica que S100A12 pode inibir o crescimento ea viabilidade de H. pylori de uma forma dependente da dose na estirpe G27 de H. pylori , e que a actividade antimicrobiana desta proteína pode ser invertida pela adição de zinco em excesso de nutrientes. Este trabalho complementa o nosso trabalho anterior indicando S100A12 exerceram atividade antimicrobiana contra PMSS1 e 7.13 de H. pylori , demonstrando sua ampla atividade antibacteriana contra numerosos isolados clínicos e linhagens de H. pylori adaptadas ao laboratório 18 . Juntos, estes resultados confirmam a importância de S100A12 como um mecanismo para controlar o crescimento bacteriano e proliferação via imunidade nutricional. Futuros estudos desta importante interacção hospedeiro-bactéria poderiam incluir explorar a actividade de S100A12 para reduzir a carga bacteriana dentro dos tecidos do hospedeiro ou determinar a contribuição desta proteína para a sinalização imune no contexto da infecção por H. pylori .

Protocol

1. Expressão de S100A12 Transformar células BL21 DE3 competentes com um plasmídeo pGEMEX-S100a12 utilizando um protocolo padrão de choque térmico 18 . Adicionar 1 a 5 μL de plasmídeo a 50 μL de bactérias num tubo de microcentrífuga em gelo. Incubar durante 20 min. Aquecer as células a 42 ° C durante 30 s. Incubar as células em gelo durante 2 min. Adicionar 500 μL de meio SOC às células. Incubar a 37 ° C com agitação a 250 rpm num agitado…

Representative Results

S100A12 expressão e purificação Uma purificação em três passos produziu ~ 40 mg de S100A12 recombinante a partir de 50 mL de cultura bacteriana. O primeiro passo foi uma precipitação com sulfato de amónio de proteínas endógenas de E. coli . Este passo foi seguido por cromatografia de permuta aniónica ( Figura 1A ). A proteína é rastreada por uma SDS-PAGE corada com Coomassi…

Discussion

É apresentado um protocolo eficiente para expressão e purificação de S100A12 humano. O sistema de expressão de E. coli é a ferramenta mais comum usada para a produção de proteínas recombinantes, particularmente quando são necessárias quantidades de mg para estudos bioquímicos e biofísicos. Um aperfeiçoamento chave do procedimento aqui descrito é o uso de meios de auto-indução 26 que aumenta o rendimento da proteína purificada por um factor de quase trinta em comparaçã…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo Departamento de Veteranos Assuntos Carreira Desenvolvimento Award 1IK2BX001701, CTSA prêmio UL1TR000445 do Centro Nacional para o Avanço Translational Sciences, o National Science Foundation Award Números 1547757 e 1400969, e NIH concessão GM05551. Seu conteúdo é exclusivamente da responsabilidade dos autores e não representam necessariamente visões oficiais do Centro Nacional para o Avanço das Ciências Translacionais ou dos Institutos Nacionais de Saúde.

Materials

S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250X) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

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Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).

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