Ekspression, oprensning og antimikrobiell aktivitet af S100A12

Summary

Her præsenterer vi en metode til at udtrykke og rense S100A12 (calgranulin C). Vi beskriver en protokol til måling af dets antimikrobielle aktivitet mod det humane patogen H. pylori .

Abstract

Calgranulin-proteiner er vigtige mediatorer af medfødt immunitet og er medlemmer af S100-klassen af ​​EF-hånd-familien af ​​calciumbindende proteiner. Nogle S100 proteiner har evnen til at binde overgangsmetaller med høj affinitet og effektivt sekvestrere dem væk fra invaderende mikrobielle patogener i en proces, der betegnes "ernæringsmæssig immunitet". S100A12 (EN-RAGE) binder både zink og kobber og er meget rigeligt i medfødte immunkeller, såsom makrofager og neutrofiler. Vi rapporterer en raffineret metode til udtryk, berigelse og oprensning af S100A12 i sin aktive, metalbindende konfiguration. Udnyttelse af dette protein i bakteriel vækst og levedygtighedsanalyser viser, at S100A12 har antimikrobiel aktivitet mod bakteriepatogenet Helicobacter pylori . Den antimikrobielle aktivitet er baseret på den zinkbindende aktivitet af S100A12, som chelaterer næringsstofzink og derved sultner H. pylori, der kræver zink til vækst og proliferation.

Introduction

S100 proteiner er en klasse af EF-hånd-familien af ​​calciumbindende proteiner med en bred vifte af funktioner ¹ . De udtrykkes på en vævs- og celle-specifik måde og regulerer et bredt spektrum af cellulære funktioner ^{2 , 3} . Unikke til calciumbindende proteiner, S100 proteiner udviser både intracellulære og ekstracellulære funktioner ^{4 , 5} . Inden for cellen inducerer Ca2 ⁺ -binding en konformationel ændring, der udsætter en hydrofob overflade, der specifikt målretter proteinbindende partnere ⁶ . Denne intracellulære mekanisme regulerer vigtige processer som celleproliferation, differentiering og energi metabolisme. I det ekstracellulære miljø udviser S100 proteiner to funktioner ⁷ . I en fungerer de som skade-relaterede molekylære mønster (DAMP) proteiner og initierer en proinflammationAtorisk immunrespons gennem interaktion med mønstergenkendelsesreceptorer ^{8 , 9} . Derudover overfører flere medlemmer af S100 proteinklasse-sekvestrerne metaller, en funktion, der tjener til at sulte mikrobielle patogener i en procesbetegnet næringsimmunitet ^{10 , 11} .

S100A12 (også kendt som calgranulin C og EN-RAGE) udtrykkes stærkt i makrofager og neutrofiler og er blevet identificeret som en potentiel biomarkør for inflammatoriske sygdomme ^{12 , 13} . Foruden bindende calcium ved dets EF-Hand-steder har S100A12 to højaffinitetsovergangsmetalbindingssteder placeret i modsatte ender af dimerinterfacet ^{14 , 15} . Hvert bindingssted består af tre histidinrester og en asparaginsyrerest og kan chelatere zink eller kobber <Sup class = "xref"> 16 ^{, 17} . For nylig rapporterede vi, at S100A12-afhængig zinkhævelse er vigtig for regulering af Helicobacter pylori- vækst og aktiviteten af ​​proinflammatoriske virulensfaktorer ¹⁸ .

H. pylori inficerer maven på omkring halvdelen af ​​verdens menneskelige befolkning; Gør det uden tvivl et af de mest succesrige bakteriepatogener ¹⁹ . Infektion med H. pylori kan føre til betydelige gastrisk sygdomsresultater, herunder gastritis, peptisk og duodenalt sår, slimhindeassocieret lymfoidvæv (MALT) lymfom og invasivt gastrisk adenocarcinom (mavekræft). Mavekræft er den førende årsag til ikke-kardiokræft-relateret død i verden, og den største enkeltstående risikofaktor for mavekræft er infektion med H. pylori .

H. pylori fortsætter i gastrisk niche på trods af en robuSt immunrespons på patogenet, understreger behovet for en bedre forståelse af immunmekanismer til styring af denne bakterielle infektion ^{20 , 21 , 22 , 23} . H. pyloriassocieret inflammation er karakteriseret ved en dyb infiltration af polymorfonukleære celler eller neutrofiler, som deponerer et repertoire af antimikrobielle proteiner, herunder S100A12, på infektionsstedet ^{18 , 24 , 25} . For at forstå den komplekse dialog mellem vært og patogen forsøgte vi at forbedre teknikken til at rense S100A12 og bruge den til at studere den antimikrobielle påvirkning, den udøver på dette medicinsk relevante patogen. Protokollen nedenfor skitserer en forbedret teknik til S100A12 rensning i sin biologisk aktive tilstand; I stand til at binde næringsmetaller med høj affiniTy og chelaterer dem væk fra invaderende mikroorganismer. Desuden fremhæver metoderne nedenfor brugen af ​​dette protein som et kritisk reagens for at studere mekanismen, hvorved indfødte antimikrobielle molekyler begrænser væksten af ​​bakterielle patogener.

S100A-familieproteiner har opnået anerkendelse som en vigtig gruppe af medfødte immunsystemmolekyler, der deltager i immunsignaler samt værtsforsvar ²⁷ . De mest velundersøgte af disse er calprotectin (MRP-8/14, calgranulin A / B, S100A8 / A9) ^{28 , 29 , 30} . Calprotectin er et neutrofil-associeret protein, der danner en heterodimer af S100A8- og S100A9-underenhederne, der binder overgangsmetaller ved dimer-grænsefladen ³¹ . Calprotectin har vist sig at besidde to metalbindingssteder: Site 1 kan binde Zn ²⁺ , Mn ²⁺ eller Fe ²⁺ og Site 2 kan Bind Zn ^{2+ 31 , 32} . Talrige rapporter har vist, at calprotectin har antimikrobielle aktiviteter mod forskellige patogener, herunder Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli og H. pylori , og at de inhiberende virkninger skyldes metalcheleringsaktiviteten af ​​calprotectin ^{25 , 28 , 29} .

Tidligere arbejde demonstreret calprotectin udøver mange aktiviteter på H. pylori, herunder ændring af lipid A-strukturen i den ydre membran, undertrykkelse af cag-Type IV-sekretionssystemet (som er en stor proinflammatorisk virulensfaktor inden for H. pylori ), inducerende dannelse af biofilm og undertrykning H. pylori vækst og levedygtighed på en dosisafhængig mådeClass = "xref"> 25 ^{, 33} . Desuden afslørede de genetiske og biokemiske analyser den antibakterielle aktivitet af calprotectin mod H. pylori i vid udstrækning afledt af dets evne til at binde næringszink ²⁵ . H. pylori kræver zink, som det blev bestemt ved tidligere forskning, der anvendte et kemisk defineret medium for at fastslå mikronæringsstofkravene for dette patogen for at vokse og proliferere ³⁴ . Derudover var calprotectin meget rigeligt inden for H. pylori- inficerede væv og associeret med neutrofile infiltrater, hvilket indikerer at værten kan anvende calprotectin som en antimikrobiell strategi under infektion og efterfølgende inflammation ^{25 , 35} .

Nylige bevis fra objektive proteomics screeningsteknikker antyder, at under betingelser, hvor reaktive iltarter er rigelige, calprotecTin gennemgår posttranslationelle modifikationer, som ændrer hexa-histidinbindingsstedet og derved hæmmer proteinbindelsens metalbindende aktivitet. Som sådan antydede vi, at andre S100A-familieproteiner blandt de brede repertoar af disse molekyler kunne potentielt fungere som hjælpemetalkelatorer. Vi valgte S100A12 til videre undersøgelse, fordi den ikke blev identificeret i den ovennævnte skærm for posttranslationel modifikation, den har kapacitet til at binde zink, og den er meget rigelig i humane væv stammer fra H. pylori- inficerede individer.

Vores arbejde indikerer, at S100A12 kan hæmme H. pylori- vækst og levedygtighed på en dosisafhængig måde i H. pylori- G27-stammen, og at den antimikrobielle aktivitet af dette protein kan reverseres ved tilsætning af overskydende næringsstofsink. Dette arbejde supplerer vores tidligere arbejde med angivelse af S100A12 udøvet antimikrobiel aktivitet mod PMSS1 og 7.13-stammer af H. pylori , der demonstrerer sin brede antibakterielle aktivitet mod talrige kliniske isolater og laboratorie-tilpassede stammer af H. pylori ¹⁸ . Sammen bekræfter disse resultater betydningen af ​​S100A12 som en mekanisme til at kontrollere bakteriel vækst og proliferation via ernæringsimmunitet. Fremtidige undersøgelser af denne vigtige værtsbakterieinteraktion kan omfatte udnyttelse af aktiviteten af ​​S100A12 for at reducere bakteriel byrde i værtsvæv eller bestemmelse af dette proteins bidrag til immun signalering i forbindelse med H. pylori- infektion.

Protocol

1. Ekspression af S100A12 Transform kompetente BL21 DE3 celler med et pGEMEX-S100a12 plasmid ved hjælp af en standard varmchokprotokol 18 . Tilsæt 1 til 5 μl plasmid til 50 μl bakterier i et mikrocentrifugerør på is. Inkubér i 20 min. Varme choker cellerne ved 42 ° C i 30 s. Inkubér cellerne på is i 2 minutter. Tilsæt 500 μL SOC medier til cellerne. Inkuber ved 37 ° C med omrystning ved 250 omdr./min. På en orbital shaker i 1 time. …

Representative Results

S100A12-ekspression og oprensning En tre-trins oprensning producerede ~ 40 mg rekombinant S100A12 fra 50 ml bakteriekultur. Det første trin var en ammoniumsulfatudfældning af endogene E. coli- proteiner. Dette trin blev efterfulgt af anionbytningskromatografi ( figur 1A ). Proteinet spores af en SDS-PAGE farvet med Coomassie Brilliant Blue ( Figur 1B ). Det sidste trin…

Discussion

En effektiv protokol til både ekspression og oprensning af human S100A12 er præsenteret. E. coli ekspressionssystemet er det mest almindelige værktøj, der anvendes til fremstilling af rekombinante proteiner, især når der kræves mg mængder til biokemiske og biofysiske undersøgelser. En nøgleforøgelse af fremgangsmåden beskrevet her er brugen af ​​auto-induktionsmedium ^26, som forøger udbyttet af oprenset protein med en faktor på næsten tredive sammenlignet med ekspressi…

Materials

S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells	New England Biolabs	C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract	Research Products International	Y20020-250.0
NaCl	Research Products International	S23020-500.0
Tryptone	Research Products International	T60060-250.0
FeCl3	Sigma-Aldrich	F2877
MgSO4	Research Products International	M65240-100.0
Na2HPO4	Research Products International	S23100-500.0
KH2PO4	Research Products International	P41200-500.0
NH4Cl	Research Products International	A20424-500.0
Na2SO4	Research Products International	S25150-500.0
Glycerol	Research Products International	G22020-1.0
D-glucose	Research Products International	G32040-500.0
lactose	Sigma-Aldrich	L2643
Selection agent
ampicillin	Research Products International	A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System	GE	29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow	GE	17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR	GE	17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	ND-LITE
Tris Base	Research Products International	T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates	Lab Supply Company	BBL221261
Brucella broth	Sigma-Aldrich	B3051
Cholesterol (250X)	Thermo Fisher Scientific	12531018
NaCl	Sigma-Aldrich	793566
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich	M6250
Tris Base	Sigma-Aldrich	T1503
Zinc Chloride	Sigma-Aldrich	229997