Summary

Expression, purification et activité antimicrobienne de S100A12

Published: May 13, 2017
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Summary

Ici, nous présentons une méthode pour exprimer et purifier S100A12 (calgranuline C). Nous décrivons un protocole pour mesurer son activité antimicrobienne contre le pathogène humain H. pylori .

Abstract

Les protéines de calgranuline sont des médiateurs importants de l'immunité innée et sont membres de la classe S100 de la famille EF de protéines de liaison au calcium. Certaines protéines S100 ont la capacité de lier les métaux de transition avec une affinité élevée et les séquestrer efficacement des pathogènes microbiens envahissants dans un processus appelé «immunité nutritionnelle». S100A12 (EN-RAGE) lie le zinc et le cuivre et est très abondant dans les cellules immunitaires innées telles que les macrophages et les neutrophiles. Nous rapportons une méthode raffinée pour l'expression, l'enrichissement et la purification de S100A12 dans sa configuration active et métallique. L'utilisation de cette protéine dans les analyses de croissance et de viabilité bactérienne révèle que S100A12 a une activité antimicrobienne contre le pathogène bactérien, Helicobacter pylori . L'activité antimicrobienne repose sur l'activité de liaison au zinc de S100A12, qui chélate le zinc nutritif, affamant H. pylori qui nécessite du zinc pour la croissance et pRolifération.

Introduction

Les protéines S100 sont une classe de la famille EF de protéines de liaison au calcium avec un éventail varié de fonctions 1 . Ils sont exprimés de manière spécifique aux tissus et aux cellules et régulent un large éventail de fonctions cellulaires 2 , 3 . Les protéines S100 sont exclusives aux protéines de liaison au calcium et présentent des fonctions intracellulaires et extracellulaires 4 , 5 . Dans la cellule, la liaison au Ca 2+ induit un changement de conformation qui expose une surface hydrophobe qui cible spécifiquement les partenaires de liaison aux protéines 6 . Ce mécanisme intracellulaire regroupe des processus importants tels que la prolifération cellulaire, la différenciation et le métabolisme énergétique. Dans le milieu extracellulaire, les protéines S100 présentent deux fonctions 7 . Dans un, ils agissent comme des protéines associées à un motif moléculaire associé (DAMP) et initient un pro-inflammatoireRéponse immunitaire de l'administration par l'interaction avec les récepteurs de reconnaissance de formes 8 , 9 . De plus, plusieurs membres de la classe de protéines S100 séquestrent des métaux de transition, une fonction qui sert à affamer les agents pathogènes microbiens dans un processus appelé immunité nutritionnelle 10 , 11 .

S100A12 (également connu sous le nom de calgranuline C et EN-RAGE) est fortement exprimé dans les macrophages et les neutrophiles et a été identifié comme un biomarqueur potentiel pour les maladies inflammatoires 12 , 13 . En plus de la liaison du calcium sur ses sites EF-Hand, S100A12 comporte deux sites de liaison de métal de transition à haute affinité situés aux extrémités opposées de l'interface dimère 14 , 15 . Chaque site de liaison est composé de trois résidus d'histidine et d'un résidu d'acide aspartique et peut chélater le zinc ou le cuivre <Sup class = "xref"> 16 , 17 . Récemment, nous avons signalé que la famine de zinc dépendante de S100A12 est importante pour réguler la croissance de Helicobacter pylori et l'activité de facteurs de virulence pro-inflammatoires 18 .

H. pylori infecte l'estomac d'environ la moitié de la population humaine mondiale; Ce qui fait sans doute l'un des agents pathogènes bactériens les plus réussis 19 . L'infection par H. pylori peut conduire à des résultats significatifs de la maladie gastrique, y compris la gastrite, l'ulcère peptique et duodénal, le lymphome du tissu lymphoïde associé à la muqueuse (MALT) et l'adénocarcinome gastrique invasif (cancer de l'estomac). Le cancer de l'estomac est la principale cause de décès par cancer non cardiaque dans le monde et le plus grand facteur de risque associé au cancer de l'estomac est une infection par H. pylori .

H. pylori persiste dans la niche gastrique malgré un robouSt réponse immunitaire à l'agent pathogène, soulignant la nécessité d'une meilleure compréhension des mécanismes immunitaires de lutte contre cette infection bactérienne 20 , 21 , 22 , 23 . L' inflammation associée à H. pylori est caractérisée par une infiltration profonde des cellules polymorphonucléaires, ou des neutrophiles, qui déposent un répertoire de protéines antimicrobiennes, y compris S100A12, au site d'infection 18 , 24 , 25 . Dans le but de comprendre le dialogue complexe entre l'hôte et l'agent pathogène, nous avons cherché à affiner la technique pour purifier le S100A12 et l'utiliser pour étudier l'effet antimicrobien qu'il exerce sur ce pathogène médicalement pertinent. Le protocole ci-dessous décrit une technique améliorée pour la purification de S100A12 dans son état biologiquement actif; Capable de lier des métaux nutritifs avec des affini élevésEt les chélage des microorganismes envahissants. En outre, les méthodes ci-dessous mettent en évidence l'utilité de cette protéine en tant que réactif critique pour étudier le mécanisme par lequel les molécules antimicrobiennes innées limitent la croissance des agents pathogènes bactériens.

Les protéines de la famille S100A se sont accrues en tant que groupe important de molécules du système immunitaire inné qui participent à la signalisation immunitaire ainsi qu'à la défense de l'hôte 27 . Le plus bien étudié est la calprotectine (MRP-8/14, calgranuline A / B, S100A8 / A9) 28 , 29 , 30 . La calprotéctine est une protéine associée aux neutrophiles qui forme un hétérodimère des sous-unités S100A8 et S100A9 qui se lient aux métaux de transition à l'interface dimère 31 . On a montré que la calprotéctine possède deux sites de liaison métallique: le site 1 peut lier Zn 2+ , Mn 2+ ou Fe 2+ , et le site 2 peut Liez Zn 2+ 31 , 32 . De nombreux rapports ont démontré que la calprotectine a des activités antimicrobiennes contre divers agents pathogènes, y compris Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli et H. pylori , et que les effets inhibiteurs sont dus à l'activité de chélation du métal de la calprotectine 25 , 28 , 29 .

Les travaux antérieurs démontrent que la calprotectine exerce de nombreuses activités sur H. pylori, y compris la modification de la structure de lipide A dans la membrane externe, la rétention du système de sécrétion de type IV (qui est un facteur de virulence proinflammatoire majeur au sein de H. pylori ), induisant une formation de biofilm et réprimant La croissance et la viabilité de H. pylori de manière dose-dépendanteClass = "xref"> 25 , 33 . De plus, les études génétiques et biochimiques révèlent que l'activité antibactérienne de la calprotectine contre H. pylori découle en grande partie de sa capacité à lier le zinc nutritif 25 . H. pylori requiert du zinc, comme l'ont déterminé les recherches précédentes, qui utilisaient un milieu chimiquement défini pour déterminer les besoins en micronutriments pour que ce pathogène se développe et prolifère 34 . En outre, la calprotectine était très abondante dans les tissus infectés par H. pylori et associée à des infiltrats neutrophiles, ce qui indique que l'hôte peut utiliser la calprotectine comme stratégie antimicrobienne pendant l'infection et une inflammation subséquente 25 , 35 .

Des preuves récentes provenant de techniques de dépistage protéomiques impartiales suggèrent que, dans des conditions où les espèces réactives d'oxygène sont nombreuses, CalprotecL'étain subit des modifications post-traductionnelles qui modifient le site de liaison de l'hexa-histidine, inhibant ainsi l'activité de liaison de métal de la protéine 36 . En tant que tel, nous avons émis l'hypothèse que d'autres protéines de la famille S100A parmi le large répertoire de ces molécules pourraient potentiellement agir comme des chélateurs métalliques auxiliaires. Nous avons sélectionné S100A12 pour une étude approfondie car il n'a pas été identifié dans l'écran précité pour la modification post-traductionnelle, il a la capacité de lier le zinc et il est très abondant dans les tissus humains dérivés des individus infectés par H. pylori .

Notre travail indique que S100A12 peut inhiber la croissance et la viabilité de H. pylori de manière dose-dépendante dans la souche G27 de H. pylori et que l'activité antimicrobienne de cette protéine peut être inversée par l'ajout d'excès de nutriment au zinc. Ce travail complète notre travail précédent indiquant que S100A12 a exercé une activité antimicrobienne contre PMSS1 et 7.13 souches de H. pylori , démontrant sa large activité antibactérienne contre de nombreux isolats cliniques et souches adaptées au laboratoire de H. pylori 18 . Ensemble, ces résultats confirment l'importance du S100A12 comme mécanisme de lutte contre la prolifération et la prolifération des bactéries par immunité nutritionnelle. Des études futures de cette importante interaction hôte-bactérienne pourraient inclure l'exploitation de l'activité de S100A12 pour réduire le fardeau bactérien dans les tissus de l'hôte ou déterminer la contribution de cette protéine à la signalisation immunitaire dans le contexte de l' infection par H. pylori .

Protocol

1. Expression de S100A12 Transformer les cellules BL21 DE3 compétentes avec un plasmide pGEMEX-S100a12 en utilisant un protocole de choc thermique 18 standard. Ajouter 1 à 5 μL de plasmide à 50 μL de bactéries dans un tube de microcentrifugeuse sur de la glace. Incuber pendant 20 min. Choc thermique des cellules à 42 ° C pendant 30 s. Incuber les cellules sur de la glace pendant 2 min. Ajouter 500 μL de support SOC aux cellules. Incuber à 37 ° C…

Representative Results

S100A12 expression et purification Une purification en trois étapes a produit ~ 40 mg de S100A12 recombinant à partir de 50 ml de culture bactérienne. La première étape était une précipitation au sulfate d'ammonium de protéines endogènes de E. coli . Cette étape a été suivie d'une Chromatographie d'échange d'anions ( figure 1A ). La protéine est suivie par u…

Discussion

Un protocole efficace pour l'expression et la purification du S100A12 humain est présenté. Le système d'expression de E. coli est l'outil le plus commun utilisé pour la production de protéines recombinantes, en particulier lorsque des quantités de mg sont requises pour des études biochimiques et biophysiques. Une amélioration clé de la procédure décrite ici est l'utilisation de moyens d'induction automatique 26 qui augmentent le rendement de la protéine pu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette recherche a été appuyée par le Prix de développement des carrières du ministère des Anciens Combattants 1IK2BX001701, le prix CTSA UL1TR000445 du Centre national pour l'avancement des sciences translationnelles, les numéros de prix de la National Science Foundation 1547757 et 1400969 et la subvention NIH GM05551. Son contenu relève exclusivement des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels du Centre national pour l'avancement des sciences de la traduction ou des Instituts nationaux de santé.

Materials

S100A12 Expression
Expression cells
BL 21 (DE3) competent cells New England Biolabs C25271
Autoinduction medium components
Yeast Extract Research Products International Y20020-250.0
NaCl Research Products International S23020-500.0
Tryptone Research Products International T60060-250.0
FeCl3 Sigma-Aldrich F2877
MgSO4 Research Products International M65240-100.0
Na2HPO4 Research Products International S23100-500.0
KH2PO4 Research Products International P41200-500.0
NH4Cl Research Products International A20424-500.0
Na2SO4 Research Products International S25150-500.0
Glycerol Research Products International G22020-1.0
D-glucose Research Products International G32040-500.0
lactose Sigma-Aldrich L2643
Selection agent
ampicillin Research Products International A40040-5.0
S100A12 Purification
AKTA Start Chromatography System GE 29-220-94
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow GE 17-5156-01
HiPrep 16/60 S-200 HR GE 17-1166-01
Nanodrop lite spectrophotometer Thermo Fisher Scientific ND-LITE
Tris Base Research Products International T60040-1000.0
H. pylori Culture
Blood agar plates Lab Supply Company BBL221261
Brucella broth Sigma-Aldrich B3051
Cholesterol (250X) Thermo Fisher Scientific 12531018
NaCl Sigma-Aldrich 793566
CaCl2 Sigma-Aldrich C4901
β-mercaptoethanol Sigma-Aldrich M6250
Tris Base Sigma-Aldrich T1503
Zinc Chloride Sigma-Aldrich 229997

References

  1. Schiopu, A., Cotoi, O. S. S100A8 and S100A9: DAMPs at the crossroads between innate immunity, traditional risk factors, and cardiovascular disease. Mediators Inflamm. 2013, 828354 (2013).
  2. Chen, B., et al. S100A9 induced inflammatory responses are mediated by distinct damage associated molecular patterns (DAMP) receptors in vitro and in vivo. PLoS One. 10 (2), e0115828 (2015).
  3. Chernov, A. V., et al. The calcium-binding proteins S100A8 and S100A9 initiate the early inflammatory program in injured peripheral nerves. J Biol Chem. 290 (18), 11771-11784 (2015).
  4. Fanjul, M., et al. Presence of MRP8 and MRP14 in pancreatic cell lines: differential expression and localization in CFPAC-1 cells. Am J Physiol. 268 (5 Pt 1), C1241-C1251 (1995).
  5. Vogl, T., Gharibyan, A. L., Morozova-Roche, L. A. Pro-inflammatory S100A8 and S100A9 proteins: self-assembly into multifunctional native and amyloid complexes. Int J Mol Sci. 13 (3), 2893-2917 (2012).
  6. Smith, S. P., Shaw, G. S. A change-in-hand mechanism for S100 signalling. Biochem Cell Biol. 76 (2-3), 324-333 (1998).
  7. Bresnick, A. R., Weber, D. J., Zimmer, D. B. S100 proteins in cancer. Nat Rev Cancer. 15 (2), 96-109 (2015).
  8. Leclerc, E., Heizmann, C. W. The importance of Ca2+/Zn2+ signaling S100 proteins and RAGE in translational medicine. Front Biosci (Schol Ed). 3, 1232-1262 (2011).
  9. Goyette, J., Geczy, C. L. Inflammation-associated S100 proteins: new mechanisms that regulate function. Amino Acids. 41 (4), 821-842 (2011).
  10. Kehl-Fie, T. E., Skaar, E. P. Nutritional immunity beyond iron: a role for manganese and zinc. Curr Opin Chem Biol. 14 (2), 218-224 (2010).
  11. Zackular, J. P., Chazin, W. J., Skaar, E. P. Nutritional Immunity: S100 Proteins at the Host-Pathogen Interface. J Biol Chem. 290 (31), 18991-18998 (2015).
  12. Realegeno, S., et al. S100A12 Is Part of the Antimicrobial Network against Mycobacterium leprae in Human Macrophages. PLoS Pathog. 12 (6), e1005705 (2016).
  13. Perera, C., McNeil, H. P., Geczy, C. L. S100 Calgranulins in inflammatory arthritis. Immunol Cell Biol. 88 (1), 41-49 (2010).
  14. Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
  15. Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. J Mol Biol. 391 (3), 536-551 (2009).
  16. Moroz, O. V., Dodson, G. G., Wilson, K. S., Lukanidin, E., Bronstein, I. B. Multiple structural states of S100A12: A key to its functional diversity. Microsc Res Tech. 60 (6), 581-592 (2003).
  17. Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chem Sci. 7 (2), 1338-1348 (2016).
  18. Haley, K. P., et al. The Human Antimicrobial Protein Calgranulin C Participates in Control of Helicobacter pylori Growth and Regulation of Virulence. Infect Immun. 83 (7), 2944-2956 (2015).
  19. Cover, T. L., Blaser, M. J. Helicobacter pylori in health and disease. Gastroenterology. 136 (6), 1863-1873 (2009).
  20. Tham, K. T., et al. Helicobacter pylori genotypes, host factors, and gastric mucosal histopathology in peptic ulcer disease. Hum Pathol. 32 (3), 264-273 (2001).
  21. Wotherspoon, A. C., Ortiz-Hidalgo, C., Falzon, M. R., Isaacson, P. G. Helicobacter pylori-associated gastritis and primary B-cell gastric lymphoma. Lancet. 338 (8776), 1175-1176 (1991).
  22. Correa, P., Piazuelo, M. B. The gastric precancerous cascade. J Dig Dis. 13 (1), 2-9 (2012).
  23. de Martel, C., Forman, D., Plummer, M. Gastric cancer: epidemiology and risk factors. Gastroenterol Clin North Am. 42 (2), 219-240 (2013).
  24. Algood, H. M., Gallo-Romero, J., Wilson, K. T., Peek, R. M., Cover, T. L. Host response to Helicobacter pylori infection before initiation of the adaptive immune response. FEMS Immunol Med Microbiol. 51 (3), 577-586 (2007).
  25. Gaddy, J. A., et al. The host protein calprotectin modulates the Helicobacter pylori cag type IV secretion system via zinc sequestration. PLoS Pathog. 10 (10), e1004450 (2014).
  26. Studier, F. W. Stable expression clones and auto-induction for protein production in E. coli. Methods Mol Biol. 1091, 17-32 (2014).
  27. Gilston, B. A., Skaar, E. P., Chazin, W. J. Binding of transition metals to S100 proteins. Sci China Life Sci. 59 (8), 792-801 (2016).
  28. Corbin, B. D., et al. Metal chelation and inhibition of bacterial growth in tissue abscesses. Science. 319 (5865), 962-965 (2008).
  29. Kehl-Fie, T. E., et al. Nutrient metal sequestration by calprotectin inhibits bacterial superoxide defense, enhancing neutrophil killing of Staphylococcus aureus. Cell Host Microbe. 10 (2), 158-164 (2011).
  30. Liu, J. Z., et al. Zinc sequestration by the neutrophil protein calprotectin enhances Salmonella growth in the inflamed gut. Cell Host Microbe. 11 (3), 227-239 (2012).
  31. Damo, S. M., et al. Molecular basis for manganese sequestration by calprotectin and roles in the innate immune response to invading bacterial pathogens. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (10), 3841-3846 (2013).
  32. Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nat Chem Biol. 11 (10), 765-771 (2015).
  33. Gaddy, J. A., et al. Helicobacter pylori Resists the Antimicrobial Activity of Calprotectin via Lipid A Modification and Associated Biofilm Formation. MBio. 6 (6), e01349-e01315 (2015).
  34. Testerman, T. L., Conn, P. B., Mobley, H. L., McGee, D. J. Nutritional requirements and antibiotic resistance patterns of Helicobacter species in chemically defined media. J Clin Microbiol. 44 (5), 1650-1658 (2006).
  35. Leach, S. T., Mitchell, H. M., Geczy, C. L., Sherman, P. M., Day, A. S. S100 calgranulin proteins S100A8, S100A9 and S100A12 are expressed in the inflamed gastric mucosa of Helicobacter pylori-infected children. Can J Gastroenterol. 22 (5), 461-464 (2008).
  36. Wilkie-Grantham, R. P., et al. Myeloperoxidase-dependent lipid peroxidation promotes the oxidative modification of cytosolic proteins in phagocytic neutrophils. J Biol Chem. 290 (15), 9896-9905 (2015).

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Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. J. Vis. Exp. (123), e55557, doi:10.3791/55557 (2017).

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