यहां, हम S100A12 (कैलगनुलिन सी) को व्यक्त और शुद्ध करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। हम मानव रोगज़न एच। पाइलोरी के खिलाफ इसकी रोगाणुरोधी गतिविधि को मापने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं।
कैल्ग्रेन्युलिन प्रोटीन जन्मजात प्रतिरक्षा के महत्वपूर्ण मध्यस्थ हैं और कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन के ईएफ-हाथ परिवार के एस -100 वर्ग के सदस्य हैं। कुछ एस 100 प्रोटीन में उच्च आत्मीयता के साथ संक्रमण धातुओं को बाँधने की क्षमता होती है और उन्हें "पोषण प्रतिरक्षा" कहा जाता है जो प्रक्रिया में माइक्रोबियल रोगज़नक़ों पर हमला करने से प्रभावी रूप से अलग हो जाते हैं। एस -100 ए 12 (एन-रेजेस) जस्ता और तांबा दोनों को बांधता है और सहज प्रतिरक्षा कोशिकाओं जैसे कि मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल में अत्यधिक प्रचुर मात्रा में होता है। हम अपनी सक्रिय, मेटल बाइंडिंग कॉन्फ़िगरेशन में S100A12 की अभिव्यक्ति, संवर्धन और शुद्धि के लिए एक परिष्कृत विधि की रिपोर्ट करते हैं। जीवाणु वृद्धि और व्यवहार्यता विश्लेषण में इस प्रोटीन का उपयोग बताता है कि एस -1 ए 1 ए 12 में जीवाणु रोगजन, हेलिकोबैक्टर पाइलोरी के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि है। रोगाणुरोधी गतिविधि S100A12 की जस्ता बाध्यकारी गतिविधि पर आधारित होती है, जो पोषक तत्व जस्ता को chelates करती है, जिससे एच। पाइलोरी भूख से पीड़ित होती है जिसके लिए विकास की जस्ता की आवश्यकता होती है और पीroliferation।
एस 1100 प्रोटीन, कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन के ईएफ-हाथ परिवार का एक वर्ग है, जिसमें कार्य 1 के विविध सरणी हैं। वे एक ऊतक और सेल विशिष्ट तरीके से व्यक्त होते हैं, और सेलुलर फ़ंक्शंस 2 , 3 के एक व्यापक स्पेक्ट्रम को विनियमित करते हैं। कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन के लिए अद्वितीय, एस 100 प्रोटीन दोनों इंट्रासेल्युलर और बाह्य कार्य 4 , 5 प्रदर्शित करता है। सेल के भीतर, सीए 2+ बाध्यकारी एक गठनात्मक परिवर्तन लाती है जो एक हाइड्रोफोबिक सतह को उजागर करती है जो विशेष रूप से प्रोटीन बंधन साझेदारों को लक्षित करती है यह इंट्रासेल्युलर तंत्र महत्वपूर्ण प्रक्रियाओं जैसे सेल प्रसार, भेदभाव और ऊर्जा चयापचय को नियंत्रित करता है। बाह्य वातावरण में, एस 100 प्रोटीन दो फ़ंक्शंस प्रदर्शित करता है 7 । एक में, वे क्षति से जुड़े अणु पैटर्न (डीएएमपी) प्रोटीन के रूप में काम करते हैं और एक प्रो-इन्फलम शुरू करते हैंपैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स 8 , 9 के साथ बातचीत के माध्यम से अंधविश्वास प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया इसके अतिरिक्त, S100 प्रोटीन वर्ग सेक्जेस्टर ट्रांजिशन मेटल्स के कई सदस्य, एक समारोह जो माइक्रोबियल रोगजनकों को प्रोटीन में प्रोटीन करते हैं, जो पोषण उन्मुक्ति 10 , 11 कहते हैं ।
S100A12 (जिसे कैलगनुलिन सी और एन-रेज के नाम से भी जाना जाता है) मैक्रोफेज और न्यूट्रोफिल में अत्यधिक व्यक्त किया गया है और इसे भड़काऊ बीमारियों के लिए संभावित जैवमार्कर के रूप में पहचाना गया है 12 , 13 । अपने ईएफ-हाथ साइटों पर कैल्शियम बंधन के अलावा, एस 100 ए 12 में डिमर अंतरफलक 14 , 15 के विपरीत छोर पर स्थित दो उच्च संबंध संक्रमण धातु बंधन वाली साइटें हैं। प्रत्येक बाध्यकारी साइट में तीन हिस्टडीन अवशेषों और एक एस्पैक्टिक एसिड अवशेष शामिल होते हैं और जस्ता या तांबे की चोंच कर सकते हैं <Sup वर्ग = "xref"> 16 , 17 हाल ही में, हमने बताया कि हीलिकोबैक्टर पाइलोरी वृद्धि को नियंत्रित करने और प्रो-भड़काऊ विषमता कारकों की गतिविधि 18 को नियंत्रित करने के लिए S100A12- आश्रित जस्ता भुखमरी महत्वपूर्ण है।
एच। पाइलोरी दुनिया की आबादी के आधे हिस्से के पेट को संक्रमित करता है; यह यकीनन सबसे सफल बैक्टीरियल रोगजनकों में से एक 19 एच। पाइलोरी के साथ संक्रमण, गैस्ट्रिटिस, पेप्टिक और डुओडानल अल्सर, श्लेष्मल सम्मिलित लिम्फोइड टिशू (एमएएलटी) लिंफोमा, और इनवेसिव गैस्ट्रिक एडोनोकैरिनोमा (पेट कैंसर) सहित महत्वपूर्ण गैस्ट्रिक बीमारी के परिणाम पैदा कर सकता है। पेट कैंसर दुनिया में गैर-कार्डिया कैंसर से जुड़े मौत का प्रमुख कारण है, और पेट कैंसर के लिए सबसे बड़ा जुड़ा जोखिम वाला पहलू एच। पाइलोरी के साथ संक्रमण है।
एच। पाइलोरी एक रोबू के बावजूद गैस्ट्रिक आला में मौजूद हैजीवाणु संक्रमण के प्रति प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया , जीवाणु संक्रमण 20 , 21 , 22 , 23 को नियंत्रित करने के प्रतिरक्षा तंत्र की बेहतर समझ की आवश्यकता को रेखांकित करना। एच। पाइलोरी- सहसंबंधित सूजन पॉलिमोरफोन्यूक्लियर कोशिकाओं, या न्युट्रोफिल के गहन घुसपैठ की विशेषता है, जो 18 18 , 24 , 25 को संक्रमण के स्थल पर एस 100 ए 12 समेत रोगाणुरोधी प्रोटीन के एक प्रदर्शन की सूची प्रस्तुत करते हैं। मेजबान और रोगजनन के बीच जटिल बातचीत को समझने के प्रयास में, हमने तकनीक को परिशोधित करने के लिए S100A12 को शुद्ध करने की कोशिश की और रोगाणुरोधी प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इसे इस्तेमाल करने के लिए इसका उपयोग इस चिकित्सकीय रूप से संबंधित रोगज़नक़ पर किया। प्रोटोकॉल नीचे अपने जैविक रूप से सक्रिय राज्य में S100A12 शुद्धि के लिए एक बेहतर तकनीक की रूपरेखा; उच्च एफिनी के साथ पोषक तत्वों की बाइंडिंग करने में सक्षमटी और उन्हें सूक्ष्मजीवों पर हमला करने से दूर चित्ती। इसके अलावा, नीचे की विधियां इस प्रोटीन की उपयोगिता को एक महत्वपूर्ण अभिकर्मक के रूप में उजागर करती हैं जो तंत्र का अध्ययन करती हैं जिसके द्वारा सहज रोगाणुरोधी अणु बैक्टीरियल रोगजनकों के विकास को प्रतिबंधित करते हैं।
एस -181 ए-परिवार प्रोटीन ने सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के अणुओं के एक महत्वपूर्ण समूह के रूप में प्रशंसा प्राप्त की है जो प्रतिरक्षा संकेतन के साथ-साथ मेजबान रक्षा 27 में भाग लेते हैं। इनमें से सबसे अच्छी तरह से अध्ययन किया गया कैल्प्रोटेक्टिन (एमआरपी -8 / 14, कैलग्रानुलिन ए / बी, एसए -1 एए 8 / ए 9) 28 , 29 , 30 है । कैल्प्रोटेक्टिन एक न्युट्रोफिल-संबंधित प्रोटीन है जो एस 100 ए 8 और एस 100 ए 9 सबुनेट्स के एक हेरोर्टरिमर बनाता है जो डायमर इंटरफेस 31 में संक्रमण धातुओं को बांधता है। कैलप्रोटेक्टिन को दो धातु बंधन स्थल रखने के लिए दिखाया गया है: साइट 1 को Zn 2+ , Mn 2+ , या Fe 2+ , और साइट 2 बाइंड कर सकते हैं बाध्य Zn 2 + 31 , 32 कई रिपोर्टों ने यह साबित किया है कि कैल्प्रोटेक्टिन में स्टैफिलोकोकस ऑरियस , कैंडिडा अल्बिकी , एसिनेटोबैक्टर बुमनेय , क्लेबिसिला न्यूमोनिया , एसेरचीशिया कोली और एच। पाइलोरी सहित विभिन्न रोगजनकों के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधियां होती हैं , और यह कि अवरोधक प्रभाव कैल्प्रोटेक्टिन 25 , 28 की धातु के केलेशन गतिविधि के कारण हैं , 2 9
पिछला कार्य का प्रदर्शन किया गया है, यह दर्शाता है कि कैल्शोप्रक्टिन एच। पाइलोरी पर कई गतिविधियों का इस्तेमाल करता है जिसमें बाहरी झिल्ली में लिपिड ए संरचना को बदलना शामिल है, कैग- टाईप IV स्राक्रिशन सिस्टम (जो एच। पाइलोरी के भीतर एक प्रमुख प्रिमफ्लमाट्री वायरलेंस कारक है) को दमन कर रहा है, बायोफिल्म गठन को उत्प्रेरित करना, और दमन एच। एक खुराक पर निर्भर तरीके से पाइलोरी वृद्धि और व्यवहार्यताClass = "xref"> 25 , 33 इसके अलावा, आनुवंशिक और जैव रासायनिक आभूषणों ने एच। पाइलोरी के खिलाफ कैल्प्रोटेक्टिन की जीवाणुरोधी गतिविधि का पता लगाया था जो पौष्टिक पोषक तत्वों की जस्ता 25 बाइंड करने की क्षमता से काफी हद तक उत्पन्न हुआ था। एच। पाइलोरी को जस्ता की आवश्यकता होती है, जैसा कि पिछले शोध द्वारा निर्धारित किया गया था, जो इस रोगज़नक़ा को विकसित करने और 34 पैदा करने के लिए सूक्ष्म पोषक तत्वों की आवश्यकता का पता लगाने के लिए एक रासायनिक परिभाषित माध्यम का उपयोग करता था। इसके अतिरिक्त, एच। पाइलोरी- कीटाणुओं के ऊतकों के भीतर कैल्प्रोटेक्टिन अत्यधिक प्रचुर मात्रा में था, और न्युट्रोफिलिक घुसपैठ के साथ जुड़े, यह संकेत करता है कि हो सकता है कि संक्रमण के दौरान मेजबान कैल्क्ट्रोक्टिन को एक रोगाणुरोधी रणनीति के रूप में इस्तेमाल कर सकता है और बाद में सूजन 25 , 35 ।
निष्पक्ष प्रोटिओमिक्स स्क्रीनिंग तकनीकों के हालिया साक्ष्य से पता चलता है कि ऐसी स्थिति में जहां प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियां भरपूर मात्रा में होती हैं, कैल्प्रोटेकटिन पोस्ट-ट्रांसजेलेशन सुधारों से गुजरती हैं जो हेक्सा-हिस्टीडाइन बाध्यकारी साइट को बदलती हैं, जिससे प्रोटीन 36 की धातु बाध्यकारी गतिविधि को बाधित किया जा सकता है। जैसे, हम इस परिकल्पना करते हैं कि इन अणुओं के विस्तृत प्रदर्शनों के बीच अन्य एस -181 ए-परिवार प्रोटीन संभवतः सहायक धातु-चेललेटर्स के रूप में काम कर सकते हैं। हमने आगे के अध्ययन के लिए एस 100 ए 12 का चयन किया क्योंकि इसे पोस्ट-ट्रांसलेशन के संशोधन के लिए पहले की स्क्रीन में नहीं पहचाना गया था, इसमें जस्ता बाँधने की क्षमता है, और एच। पाइलोरी- इंटेक्टेड व्यक्तियों से उत्पन्न मानव टिश्यू में यह अत्यधिक प्रचुर मात्रा में है।
हमारा काम यह दर्शाता है कि एस -1 ए 1 ए 12 एच। पाइलोरी के जी 27 तनाव में खुराक पर निर्भर तरीके से एच। पाइलोरी विकास और व्यवहार्यता को रोक सकता है, और इस प्रोटीन की एंटीबायोटिक गतिविधि अतिरिक्त पोषक जस्ता के अलावा द्वारा उलट कर सकती है। यह काम हमारे पिछले कार्य को दर्शाता है कि एसएमए 100 ए 12 ने पीएमएसएस 1 और 7.1 के खिलाफ रोगाणुरोधी गतिविधि पेश की हैएच। पाइलोरी के 3 उपभेदों, एच । पाइलोरी 18 के कई नैदानिक आइसोलेट्स और प्रयोगशाला-अनुप्रयुक्त उपभेदों के विरुद्ध इसकी व्यापक जीवाणुरोधी गतिविधि का प्रदर्शन। साथ में, ये परिणाम पोषण उन्मुक्ति के माध्यम से जीवाणु वृद्धि और प्रसार को नियंत्रित करने के लिए एक तंत्र के रूप में एस 100 ए 12 के महत्व की पुष्टि करते हैं। इस महत्वपूर्ण होस्ट-बैक्टीरियल इंटरैक्शन के भविष्य के अध्ययन में एस -100 ए 12 की गतिविधि का शोषण करने के लिए मेजबान के ऊतकों में बैक्टीरियल बोझ को कम किया जा सकता है या एच। पाइलोरी संक्रमण के संदर्भ में प्रतिरक्षा संकेतन के लिए इस प्रोटीन का योगदान निर्धारित किया जा सकता है।
मानव S100A12 के अभिव्यक्ति और शुद्धि दोनों के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल प्रस्तुत किया गया है। ई। कोलाई अभिव्यक्ति प्रणाली, पुनः संयोजक प्रोटीन के उत्पादन के लिए इस्तेमाल किया जाने वाला सबसे सामान्य उपकरण …
The authors have nothing to disclose.
इस शोध के लिए वयोवृद्ध मामलों के कैरियर विकास पुरस्कार 1IK2BX001701, सीटीएसए पुरस्कार UL1TR000445 विभाग ने नेशनल सेंटर फॉर एडवांस ट्रांसजनल साइंसेज, नेशनल साइंस फाउंडेशन अवार्ड नम्बर 1547757 और 1400969 और एनआईएच ग्रान GM05551 द्वारा समर्थित किया गया। इसकी सामग्री पूरी तरह से लेखकों की जिम्मेदारी है और जरूरी नहीं कि नेशनल सेंटर फॉर अग्रिम ट्रांसजनल साइंसेज या नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हेल्थ के आधिकारिक विचारों का प्रतिनिधित्व न करें।
S100A12 Expression | ||
Expression cells | ||
BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 |
Autoinduction medium components | ||
Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 |
NaCl | Research Products International | S23020-500.0 |
Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 |
FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 |
MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 |
Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 |
KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 |
NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 |
Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 |
Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 |
D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 |
lactose | Sigma-Aldrich | L2643 |
Selection agent | ||
ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 |
S100A12 Purification | ||
AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 |
HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 |
HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 |
Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE |
Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 |
H. pylori Culture | ||
Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 |
Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 |
Cholesterol (250X) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 |
NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 |
β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 |
Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |