S100A12의 발현, 정제 및 항균 활성
Summary
여기에서는 S100A12 (calgranulin C)를 발현 및 정제하는 방법을 제시합니다. 우리는 인간 병원균 H. pylori 에 대한 항균 활성을 측정하기위한 프로토콜을 설명합니다.
Abstract
Calgranulin 단백질은 타고난 면제의 중요한 매개체이며 칼슘 결합 단백질 인 EF-hand 계열의 S100 클래스의 구성원입니다. 일부 S100 단백질은 전이 금속을 높은 친 화성으로 결합시킬 수 있고 "영양 면역"과정에서 미생물 병원균 침입으로부터 효과적으로 격리 할 수 있습니다. S100A12 (EN-RAGE)는 아연과 구리를 모두 결합하며 대 식세포와 호중구와 같은 타고난 면역 세포에서 매우 풍부합니다. 우리는 활성, 금속 결합 구성에서 S100A12의 발현, 농축 및 정제를위한 정제 된 방법을보고합니다. 박테리아 증식 및 생존력 분석에서이 단백질의 이용은 S100A12가 박테리아 병원체 인 Helicobacter pylori 에 항균 활성을 가지고 있음을 보여줍니다. 항균 활성은 영양소 아연을 킬레이트 화하는 S100A12의 아연 결합 활성에 기인하며, 이로 인해 아연이 성장 및 P를 필요로하는 H.pylori 가 굶어 죽는다.위험.
Introduction
S100 단백질은 다양한 기능을 가진 칼슘 결합 단백질의 일종입니다. 그것들은 조직과 세포 특유의 방식으로 발현되며 광범위한 세포 기능을 조절합니다 2 , 3 . 칼슘 결합 단백질에 고유 한 S100 단백질은 세포 내 및 세포 외 기능 모두를 나타냅니다 4 , 5 . 세포 내에서 Ca 2+ 결합은 단백질 결합 파트너를 특이 적으로 표적으로하는 소수성 표면을 노출시키는 구조 변화를 유도합니다. 이 세포 내 메커니즘은 세포 증식, 분화 및 에너지 대사와 같은 중요한 과정을 조절합니다. 세포 외 환경에서 S100 단백질은 두 가지 기능을 나타낸다. 하나는 손상된 분자 패턴 (DAMP) 단백질로 작용하고 친 염증을 일으킨다.패턴 인식 수용체와의 상호 작용을 통한 면역 반응의 초기 반응 8 , 9 . 또한 S100 단백질 군의 여러 구성원은 전이 금속을 격리하며 이는 영양 면역 10 , 11 이라고 불리는 과정에서 미생물 병원균을 굶어 죽이는 역할을한다.
S100A12 (calgranulin C 및 EN-RAGE라고도 함)는 대 식세포 및 호중구에서 많이 발현되며 염증성 질환의 잠재적 인 바이오 마커로 확인되었습니다 12 , 13 . 그것의 EF-Hand 부위에서 칼슘을 결합시키는 것 외에도, S100A12는 이량 체 인터페이스의 양단에 두 개의 고친 화성 전이 금속 결합 부위를 가지고있다 14,15. 각 결합 부위는 3 개의 히스티딘 잔기 및 1 개의 아스파르트 산 잔기로 구성되며 아연 또는 구리를 킬레이트 할 수있다 <sup class = "xref"> 16 , 17 . 최근에 우리는 S100A12 의존성 아연 결핍이 Helicobacter pylori의 성장과 염증성 독성 인자의 활성을 조절하는데 중요하다고보고했다.
헬리코박터 파일로리 (H. pylori )는 세계 인구의 약 절반에 해당하는 위장에 감염됩니다. 그것은 틀림없이 가장 성공적인 세균성 병원체 중 하나이다 19 . 헬리코박터 파이로리 감염 은 위염 , 소화성 및 십이지장 궤양, 점막 관련 림프 성 조직 (MALT) 림프종 및 침윤성 위암 (위암)을 비롯한 중대한 위암 질환의 결과로 이어질 수 있습니다. 위암은 세계에서 비 – 심장 암 관련 사망의 주요 원인이며, 위암에 대한 가장 큰 관련 위험 요소는 H. pylori 감염 입니다.
헬리코박터 파일로리 (Helicobacter pylori) 는 로브에도 불구하고 위장에 계속 존재한다.이 박테리아 감염을 통제하는 면역 기전의 더 나은 이해에 대한 필요성을 강조했다. 20 , 21 , 22 , 23 . H. pylori와 관련된 염증은 감염 부위에 S100A12를 포함한 항균성 단백질의 레파토리를 입금하는 다형 핵 세포 또는 호중구의 심한 침윤을 특징으로합니다 18 , 24 , 25 . 숙주와 병원체 사이의 복잡한 대화를 이해하기 위해 S100A12를 정제하고이 의학적으로 관련이있는 병원균에 미치는 항생제 영향을 연구하기 위해이 기술을 사용하려고했습니다. 아래의 프로토콜은 생물학적 활성 상태에서의 S100A12 정제 기술을 개량 한 것입니다. 높은 affini와 영양 금속을 바인딩 할 수타이 미생물 침입으로부터 그들을 킬레이트 화시킨다. 또한, 아래의 방법은 선천적 인 항균 분자가 박테리아 병원체의 성장을 제한하는 메커니즘을 연구하기위한 중요한 시약으로서이 단백질의 유용성을 강조합니다.
S100A 계열 단백질은 숙주 방어뿐만 아니라 면역 신호 전달에 관여하는 선천성 면역계 분자의 중요한 그룹으로 인식되어왔다. 이들 중 가장 잘 연구 된 화합물은 calprotectin (MRP-8 / 14, calgranulin A / B, S100A8 / A9)입니다 (28 , 29 , 30) . Calprotectin은 이합체 계면에서 전이 금속을 결합하는 S100A8과 S100A9 서브 유닛의 헤테로 다이머를 형성하는 호중구 – 관련 단백질이다. Calprotectin은 두 개의 금속 결합 부위를 가지고있는 것으로 나타났습니다. Site 1은 Zn 2+ , Mn 2+ 또는 Fe 2+ 를 결합 할 수 있고 Site 2는 Zn 2+ 31 , 32를 결합하라. Calprotectin은 Staphylococcus aureus , Candida albicans , Acinetobacter baumannii , Klebsiella pneumoniae , Escherichia coli , H. pylori 와 같은 다양한 병원균에 대한 항균 활성을 가지고 있으며 저해 효과는 calprotectin 25 , 28 , 29 .
이전 연구에서 calprotectin은 외막의 지질 A 구조를 변경하고, H.pylori 내 주요 proinflammatory virulence factor 인 cag- Type IV 분비 시스템을 억제하고, biofilm 형성을 유도하고, 억제하는 등 헬리코박터 균에 대한 수많은 활동을 수행했다. 헬리코박터 파이로리 성장 및 생존률class = "xref"> 25 , 33 . 또한, 유전 적 및 생화학 적 분석 결과 칼로필틴의 H. pylori 에 대한 항균 활성은 주로 영양소 인 아연 결합 능력에서 비롯된 것으로 밝혀졌다. 헬리코박터 파일로리 (H. pylori) 는 아연이 필요하며,이 병원균의 미량 영양소 요구량을 확인하기 위해 화학적으로 정의 된 배지를 이용하여 성장하고 증식시키는 이전의 연구에 의해 결정되었다. 또한 칼로 펙틴은 헬리코박터 파일로리에 감염된 조직 내에서 매우 풍부하게 존재하며 호중구의 침윤 물과 관련이 있으며, 이는 감염 및 후속 염증시 항균제로 calprotectin을 사용할 수 있음을 나타냅니다 25 , 35 .
편향된 프로테오믹스 스크리닝 기술로부터 얻은 최근의 증거에 따르면, 반응성 산소 종이 풍부한 조건 하에서는 calprotec주석은 hexa-histidine 결합 부위를 변경하는 post-translational modification을 거침으로써 단백질 36 의 금속 결합 활성을 억제한다. 이와 같이, 우리는이 분자의 광범위한 레파토리 중 다른 S100A 계열 단백질이 잠재적으로 보조 금속 킬레이트 화제로 작용할 수 있다고 가정했다. S100A12는 후속 연구를 위해 전술 한 스크린에서 확인되지 않았기 때문에 S100A12를 선택했다. 아연과 결합 할 수있는 능력을 가지고 있으며 H. pylori 감염 개체에서 유래 한 인간 조직에서 매우 풍부하다.
우리의 연구 결과에 따르면 S100A12는 H. pylori 의 G27 균주에서 H. pylori의 생장 및 생존력을 용량 의존적으로 억제 할 수 있으며,이 단백질의 항균 활성은 과량의 영양소 아연을 첨가함으로써 역전 될 수 있음을 나타냅니다. 이 연구는 PMSS1 및 7.1에 대한 S100A12 항균 활성을 나타내는 이전 연구를 보완합니다3 종의 H. pylori 균주가 H. pylori 18 균주 및 임상 분리 균주에 대한 광범위한 항균 활성을 입증했다. 함께, 이러한 결과는 영양 면제를 통해 박테리아 성장 및 증식을 조절하는 메커니즘으로서 S100A12의 중요성을 확인합니다. 이 중요한 숙주 – 박테리아 상호 작용에 대한 향후 연구에는 숙주 조직 내 박테리아 부담을 줄이거 나 H. pylori 감염과 관련하여 면역 신호 전달에 대한이 단백질의 기여도를 결정하기 위해 S100A12의 활성을 이용하는 것이 포함될 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
인간 S100A12의 발현 및 정제를위한 효율적인 프로토콜이 제시됩니다. 대장균 발현 시스템은 재조합 단백질 생산에 사용되는 가장 일반적인 도구이며 특히 생화학 및 생물 물리학 연구에 mg이 필요한 경우에 사용됩니다. 여기에 설명 된 절차의 핵심적인 향상은 표준 Luria-broth media 18 을 사용한 발현과 비교하여 정제 단백질의 수율을 거의 30 배 증가시키는 자동 유도 미디어 <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 재향 군인의 직무 경력 개발 상 1IK2BX001701, 전진 과학 전담 센터의 CTSA 상 UL1TR000445, 국가 과학 재단 상 번호 1547757 및 1400969 및 NIH 부여 GM05551에 의해 지원되었습니다. 이의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 전진을위한 국립 중앙 연구소 또는 국립 보건원의 공식 견해를 대표하지는 않습니다.
Materials
| S100A12 Expression | ||
| Expression cells | ||
| BL 21 (DE3) competent cells | New England Biolabs | C25271 |
| Autoinduction medium components | ||
| Yeast Extract | Research Products International | Y20020-250.0 |
| NaCl | Research Products International | S23020-500.0 |
| Tryptone | Research Products International | T60060-250.0 |
| FeCl3 | Sigma-Aldrich | F2877 |
| MgSO4 | Research Products International | M65240-100.0 |
| Na2HPO4 | Research Products International | S23100-500.0 |
| KH2PO4 | Research Products International | P41200-500.0 |
| NH4Cl | Research Products International | A20424-500.0 |
| Na2SO4 | Research Products International | S25150-500.0 |
| Glycerol | Research Products International | G22020-1.0 |
| D-glucose | Research Products International | G32040-500.0 |
| lactose | Sigma-Aldrich | L2643 |
| Selection agent | ||
| ampicillin | Research Products International | A40040-5.0 |
| S100A12 Purification | ||
| AKTA Start Chromatography System | GE | 29-220-94 |
| HiTrap Q Sepharaose Fast Flow | GE | 17-5156-01 |
| HiPrep 16/60 S-200 HR | GE | 17-1166-01 |
| Nanodrop lite spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | ND-LITE |
| Tris Base | Research Products International | T60040-1000.0 |
| H. pylori Culture | ||
| Blood agar plates | Lab Supply Company | BBL221261 |
| Brucella broth | Sigma-Aldrich | B3051 |
| Cholesterol (250X) | Thermo Fisher Scientific | 12531018 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 |
| β-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
| Zinc Chloride | Sigma-Aldrich | 229997 |
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