بروتوكول مختبر لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية ماكروينفيرتيبراتيس المائية استخدام مجموعة محددة المتاشب كبسولة تفجير

Summary

يتم تحليل محتوى الأمعاء الأكثر شيوعاً ماكروينفيرتيبراتيس البصرية. تتطلب معرفة مكثفة عن تنوع الكائنات الحية فريسة المورفولوجية، أنها ملكة جمال الفريسة جسديا لينة، وسبب قوي كومينوشن الجارحة، يكاد يكون من المستحيل لبعض الكائنات الحية، بما في ذلك أمفيبودس. ونحن نقدم النهج الوراثية رواية مفصلة ماكروينفيرتيبراتي فريسة الهوية في النظام الغذائي من أمفيبودس.

Abstract

تحليل الشبكات الغذائية ضروري لفهم أفضل للنظم الإيكولوجية. على سبيل المثال، يمكن الخضوع للتفاعلات الشبكة الغذائية التغيرات الشديدة الناجمة عن غزو الأنواع غير الأصلية. تحديد الحقل الفرائس التفاعلات دقيقة غير صعبة في كثير من الحالات. غالباً ما تستند إلى هذه التحليلات تقييم البصري لمحتوى الأمعاء أو تحليل نسب النظائر المستقرة (δ¹⁵N و δ¹³ج). هذه الأساليب تتطلب معرفة شاملة تقريبا، على التوالي، تنوع السمات أو التوقيع النظائر المشعة من الكائنات الحية فريسة الفردية، مما يؤدي إلى عقبات في تحديد الفريسة الكائنات الحية الدقيقة. يحلل محتوى القناة الهضمية البصرية خاصة نقلل من الكائنات الناعمة الفريسة جسديا، وسبب تعطن والابتلاع والهضم من الكائنات الحية فريسة صعوبة تحديد الأنواع المحددة. ومن ثم بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR) على أساس الاستراتيجيات، على سبيل المثال استخدام التمهيدي المعينة لمجموعة مجموعات، توفر أداة قوية لتحقيق التفاعلات الشبكة الغذائية. هنا، يمكننا وصف بروتوكولات مفصلة للتحقيق في محتويات القناة الهضمية للمستهلكين ماكروينفيرتيبراتي من الحقل باستخدام مجموعات الخاصة بالفريق التمهيدي للحمض النووي ريبوسومال (المتاشب). يمكن أن يكون الحمض النووي المستخرج أما من عينات كاملة (في حالة الأصناف الصغيرة) أو الخروج من محتويات القناة الهضمية من العينات التي تم جمعها في الميدان. الوجود والكفاءة الوظيفية لقوالب الحمض النووي بحاجة إلى تأكيد مباشرة من الأفراد المختبرة التمهيدي عالمي باستخدام مجموعات تستهدف وحدة فرعية كل منها من الحمض النووي. كما نثبت أنه يمكن تحديد فريسة تستهلك المزيد وصولاً إلى مستوى الأنواع عن طريق PCR مع غير معدلة خاصة بمجموعة الإشعال جنبا إلى جنب مع تكيف اللاحقة جديلة واحدة تعدد الأشكال (SSCP) تحليلات استخدام المواد الهلامية polyacrylamide. وعلاوة على ذلك، نحن تظهر أن استخدام الأصباغ الفلورية مختلفة كتسميات لتمكين الفرز موازية لشظايا من الحمض النووي للمجموعات فريسة مختلفة من عدة عينات محتوى القناة الهضمية عن طريق التحليل الآلي جزء.

Introduction

التفاعلات الفرائس، التي تشكل الغالبية من التفاعلات التغذوية وديناميات الشبكة الغذائية، هي الجوانب الرئيسية لتحديد خصائص تدفق المادة والطاقة في جميع أنحاء الشبكات الغذائية داخل وفيما بين النظم الإيكولوجية، وواحد من الأهداف الرئيسية للإيكولوجيا ¹. تحديد المصدر وتدفق الكربون والمغذيات هو الفهم للاتصال البيئي بين النظم الإيكولوجية². ومع ذلك، لا ترتبط النظم الإيكولوجية، مثل الأنهار ومستجمعات المياه بها، فقط بتدفقات المواد العضوية والعناصر الغذائية ولكن أيضا بتحركات الكائنات الحية³. وهكذا، التعديلات الموئل انقطاع تدفق الموارد التي تربط بين تلك النظم بشدة تغيير الشبكات الغذائية للنظم الإيكولوجية، وكلاهما ليس فقط مباشرة بل أيضا غير مباشر بتغيير تكوين كل منهما جماعات الفرائس. على سبيل المثال، أظهرت التغييرات في الشبكات الغذائية مرتبطة بتحركات المفترس واحد الأنواع (مثل، تراوت قوس قزح)⁴. هذه التغييرات يمكن أن تهدد التنوع البيولوجي وأداء النظم الإيكولوجية المائية. ولذلك، تحليل التفاعلات الفرائس في الميدان ضروري لتحديد أثر التغيرات البيئية التي يتسبب فيها الإنسان، مثل ممارسات إدارة المياه، على التنوع البيولوجي للنظم الإيكولوجية المائية الأصلية.

إذ من الصعب تتبع الروابط التغذوية في النظم المعقدة، تم إنشاء عدة نهج التي تمكن من تقييم التغذية التفاعلات في الحقل⁵. تقليديا، التحقيقات لتغذية التفاعلات في الميدان تستند إلى التعرف البصري من بقايا الفريسة في تشريح الشجاعة وتتطلب معرفة شاملة حول التنوع فريسة مورفولوجك. وقدمت تحليلات محتوى الأمعاء البصرية رؤى في استخدام الموارد من عدة مجموعات من المستهلكين (مثل التباين الموسمي في النظام الغذائي من جراد البحر⁶ والأسماك^7،8 أو تغذية تفضيلات من الكانفاس). بيد أن عملية الهضم المادية يجعل من الصعب تحليل محتوى القناة الهضمية البصرية وعادة ما يخطئ الفريسة جسديا لينة-الكائنات الحية⁹. لتغذية الأنواع بابتلاع السائل أو لبعض المستهلكين اللافقاريات بشكل مكثف كومينوتي الطعام قبل البلع، مثل أمفيبودس، هو التعرف البصري من الأنواع الفريسة في محتويات القناة الهضمية المستحيل¹⁰. بسبب هذه القيود، يوفر التحليل الجزيئي بديلاً واعداً.

التحليلات الجزيئية أصبحت الآن أداة مشتركة للسماح بالكشف عن فريسة السريع والدقيق في محتويات القناة الهضمية. المجموعة من هذه التقنيات المتنوعة: غالباً ما تستخدم استراتيجيات تستند إلى الأجسام المضادة أو بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (الاسترداد)، بسبب ما عالية الدقة والحساسية¹¹. تطوير الأجسام المضادة الجديدة هو كثافة الوقت والتكلفة، ولذلك، تطبيق تقنيات جزيئية أخرى مفيد أكثر عندما لا توجد أجسام مضادة بالفعل¹¹. نهج مشترك آخر تضخيم مناطق حمض الخلوي الصبغي (DNA)، مثل الجينات ريبوسومال الحمض النووي الريبي (الرنا) موجودة في معظم الأنواع، استخدام التمهيدي عالمي يحدد^12،13. عند استخدام هذا الأسلوب، أنها غالباً ما تكون غير ممكنة لتحديد النطاق الكامل للكائنات الحية فريسة داخل مصادر مختلطة من الحمض الخلوي الصبغي¹⁴. نهج فعال لتجنب مثل هذا عيب استخدام التمهيدي المعينة لمجموعة مجموعات لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية. تهدف إلى تضخيم الحمض النووي في مناطق فقط لمجموعات مستهدفة معينة واستبعاد جميع سائر الأنواع^15،16، كبسولة تفجير مجموعة محددة يمكن تحديد الكائنات فريسة على المستوى التصنيفي لفئات معينة دون التحليلات الثانوية كثافة الوقت والتكلفة. ومع ذلك، مثل كل القناة الهضمية تحليل المحتوى، توفر هذه التحليلات فقط لقطة من تغذية السلوك. ولذلك، يعتبر الجمع بين تحليل محتوى الأمعاء الجزيئية مع تحليلات لدمج الوقت تتبع الطبيعية (مثل النظائر) مفيد^1،2.

وهنا يصف لنا طريقة مفصلة للتحقيقات على أساس PCR التفاعلات الفرائس استخدام مجموعات التمهيدي الخاصة بالمجموعة لمناطق الحمض النووي (المتاشب) ريبوسومال النووية لتكون جنبا إلى جنب مع تحليل النظائر المستقرة للعينة نفسها. يصف لنا الكشف عن الحمض النووي لمجموعات فريسة واحدة عن طريق [اغروس] هلام التفريد. بالإضافة إلى ذلك، نقدم فرصة لمزيد من التحليلات المصب منتجات PCR هذه المجموعة على حدة كبسولة تفجير ينطبق عندما يكون مطلوباً دقة تصنيفية أعلى من خصوصية الإشعال. لأن الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحد (ssDNA) شظايا والتشكلات نموذج التعليم العالي التي تتحدد بها تسلسل الأولية¹⁷، الاختلافات الصغيرة في شظايا تضخيمه بتلك الخاصة بمجموعة الإشعال تؤدي إلى تغييرات كونفورماشونال. ويمكن الكشف عن هذه التغييرات بجديلة واحدة تحليلات تعدد الأشكال (SSCP) المطابقة مع الجل بولياكريلاميدي^17،18، تمكن من تحديد أكثر دقة للكائنات الحية فريسة (وصولاً إلى مستوى الأنواع).

بينما [اغروس] هلام التفريد هو أداة شائعة وغير مكلفة لتصور شظايا من الحمض النووي وتحديد الطول التقريبي¹⁹، أن القرار يعتمد على الكمية من الحمض النووي وصبغ المصبوغة تستخدم²⁰. عادة، التصور مستقيمة عند العمل مع عينات الحمض النووي نقية، ولكن يحتمل أن انخفاض كميات من فريسة الحمض النووي في محتويات القناة الهضمية من المستهلكين يمكن أن يعقد التسجيل من [اغروس] هلام التفريد النتائج. لا يزال، هذا الأسلوب الكشف عن عمليا الشاشة عدد قليل من العينات المستهلك من الحقل واحد أو فريسة بعض المجموعات، ولكن تعقيد في التهديف يجعل فحص عدد كبير من العينات للغاية مرة متعددة فريسة الأصناف مكثفة، وبالتالي غير عملي. هو أسلوب كشف أكثر حساسية التحليل الآلي للأجزاء عن طريق التفريد الشعرية، مما يسمح تحديد طول الدقيق من شظايا²¹بالإضافة إلى ذلك. أظهرت العديد من الدراسات الصغرى على أساس أنه من الممكن باستخدام الأصباغ الفلورية مختلفة كتسميات، لكشف وتحديد أجزاء مختلفة من طول قابلة للمقارنة بشظية الآلي تحليل^{22،23، 24}. ولذلك، أيضا نقدم بروتوكول مفصل لكشف موازية للحمض النووي من فريسة متعددة المجموعات باستخدام PCR مع مجموعات المسماة الخاصة بالفريق التمهيدي والكشف عن طريق تحليل جزء الآلي مع المنظم الآلي. بالإضافة إلى ذلك، فإننا نعرض النتائج دراسة حالة مما يدل على أن الكشف عن فريسة الحمض النووي عن طريق تحليل جزء الآلي هو نهج الذي يتيح أيضا إجراء تقييم كمي نسبي لفريسة بلعها.

Protocol

1-جمع ماكروينفيرتيبراتيس من الميدان وإعداد العينات لتحليل محتوى الأمعاء الوراثية. ماكروينفيرتيبراتيس جمع في كل موقع، فرز الأفراد من الأنواع المستهلك من الفائدة في أنابيب مفرد، وتجميدها مباشرة في النتروجين السائل أو الثلج الجاف لمنع إزالة القناة الهضمية وتحلل الحمض النووي- ملا?…

Representative Results

أننا استخدمت بنجاح الخطوات الموصوفة في هذا البروتوكول لتحليل النظام الغذائي ضمن دراسات مختلفة. في هذا القسم، نقدم أمثلة تصف مدى انطباق مقاطع مختلفة من البروتوكول. وكمثال على ذلك، أجريت تجربة تغذية لإثبات فعالية مجموعات التمهيدي المعينة…

Discussion

وهنا نقدم طريقة سهلة وفعالة من حيث التكلفة للتصميم القائم على بكر من التفاعلات الفرائس من العينات الميدانية عن طريق الإشعال الخاصة بالمجموعة لمناطق المتاشب، التي يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع غيرها من التحليلات غير الجزيئية للعينة نفسها. ومع ذلك، هناك العديد من الخطوات الحاسمة ضمن البروت?…

Materials

liquid nitrogen	Any	NA	For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock	Any	NA	For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope	Any	NA	Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes	Any	NA	To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7	Bioform	B40d	This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5	Bioform	B40b	This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel	Any	NA
Lab scale	Any	NA	Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	Any	NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml	VWR	211-2165	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml	VWR	211-2164	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	carlroth	8043.1	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	carlroth	4360.1	For extraction of DNA
Proteinase K lyophil.	carlroth	7528.1	Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm	Quiagen	69989	For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	Any	NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a.	Any	NA
Water Molecular biology grade (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates	VWR Peqlab	732-2879	Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes	VWR Peqlab	732-3223	Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose	Peqlab	35-1020	Used for gel electrophoresis.
Microwave	Any	NA
Conical flask	Any	NA
Measuring cylinder	Any	NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth	Any	NA	For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002	Life Technologies	NA
Ethidium bromide solution 1 %	carlroth	2218.1	Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide	carlroth	6749.1	Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose	carlroth	4621.1	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system	Any	NA	To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate	carlroth	9592.2	For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	carlroth	23.67.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker	Any	NA
RC 10 Digital chiller	VWR	462-0138	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate	VWR	730-0261	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate	VWR	730-0260	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers	VWR	730-0262	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth	VWR	730-0294	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform	Any	NA	For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS)	AB Sciex	608082	For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate	Costar	6551	For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer	AB Sciex	608012	For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI	AB Sciex	608010	For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System	Beckman Coulter	NA	For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	To analyze results of automated fragment analyses.