Protocolo de laboratorio para análisis genéticos de contenido intestinal de macroinvertebrados acuáticos con grupo-específica rDNA cartillas

Summary

Análisis de contenido intestinal más común de macroinvertebrados son visuales. Que requiere intenso conocimiento sobre la diversidad morfológica de los organismos presa, perder presa con cuerpo suave y, debido a la fuerte trituración de presa, son casi imposibles para algunos organismos, incluyendo los anfípodos. Ofrecemos detallados novela enfoques genéticos para macroinvertebrados presa de identificación en la dieta de los anfípodos.

Abstract

Análisis de redes tróficas es esencial para una mejor comprensión de los ecosistemas. Por ejemplo, las interacciones tróficas pueden sufrir cambios severos causados por la invasión de especies no autóctonas. Sin embargo, es difícil en muchos casos una identificación exacta de las interacciones depredador-presa de campo. Estos análisis a menudo se basan en una evaluación visual del contenido de la tripa o el análisis de ratios de isótopos estables (δ¹⁵N y δ¹³C). Tales métodos requieren amplio conocimiento, respectivamente, diversidad morfológica o la firma isotópica de organismos presa individual, conduce a obstáculos en la identificación exacta de organismos presa. Análisis de contenido de Visual intestino especialmente subestimar organismos presa de cuerpo suave, porque maceración, ingestión y digestión de presas organismos dificultan la identificación de especies específicas. Por lo tanto, estrategias de polimerasa en la reacción en cadena (PCR), por ejemplo el uso de la cartilla del específico de grupo se establece, brindan una herramienta poderosa para la investigación de las interacciones tróficas. Aquí, describimos protocolos detallados para investigar el contenido estomacal de los consumidores de macroinvertebrados del campo mediante sistemas específicos de grupo primer nuclear ácido desoxirribonucleico ribosómico (ADNr). ADN puede ser extraído de especímenes enteros (en el caso de taxa pequeño) o de contenido estomacal de ejemplares recolectados en el campo. Presencia y eficiencia funcional de las plantillas de ADN necesitan ser confirmado directamente desde el individuo probado usando la cartilla universal establece contra la subunidad correspondiente del DNA. También demostramos que presa consumida puede ser determinado más a nivel de especie mediante PCR con cebadores específicos de grupo sin modificar combinan con análisis de polimorfismo (SSCP) hebra posterior conformación utilizando geles de poliacrilamida. Además, nos muestran que el uso de diferentes tintes fluorescentes como etiquetas permite proyección paralela para fragmentos de ADN de grupos de presas diferentes de múltiples muestras contenido intestinal mediante el análisis del fragmento automatizado.

Introduction

Las interacciones depredador-presa, que constituyen la mayoría de las interacciones tróficas y dinámica trófica, son aspectos claves para caracterizar los flujos de materia y energía a través de redes tróficas dentro y entre ecosistemas, que es uno de los principales objetivos de la ecología ¹. la determinación de la fuente y el flujo de carbono y nutrientes es promover la comprensión de la conectividad ecológica entre los ecosistemas². Sin embargo, los ecosistemas, tales como ríos y sus cuencas, no están ligados sólo por flujos de materia orgánica y nutrientes sino también por los movimientos de los organismos³. Así, alteraciones de hábitat interrumpiendo el flujo de recursos que los sistemas pueden fuertemente alterar las redes tróficas de ambos ecosistemas, no sólo directamente sino también indirectamente cambiando la composición respectiva de las comunidades de depredador-presa. Por ejemplo, cambios de redes tróficas han demostrado para ser ligado a los movimientos de depredador solo especies (e.g., trucha arco iris)⁴. Tales cambios potencialmente amenazan la biodiversidad y el funcionamiento de los ecosistemas acuáticos. Por lo tanto, analizando las interacciones depredador-presa en el campo es esencial para determinar el impacto de los cambios ambientales inducidos por humanos, como prácticas de manejo de agua, en la biodiversidad nativa de los ecosistemas acuáticos.

Puesto que el seguimiento de los vínculos tróficos es difícil en sistemas complejos, varios acercamientos se han establecido que permiten la evaluación de la alimentación de las interacciones en el campo⁵. Tradicionalmente, las investigaciones de interacciones en el campo de la alimentación se basan en la identificación visual de los restos de la presa en intestinos disecados y requieren un amplio conocimiento acerca de la diversidad morfológica de la presa. Análisis de contenido de Visual intestino han proporcionado penetraciones en el uso de los recursos de varios grupos de consumidores (por ejemplo, variación estacional en la dieta de langosta pescado de⁶ y^7,8 o alimentación preferencias de copépodos). Sin embargo, el proceso físico de digestión dificulta el análisis de contenido de visual intestino y generalmente falta presa-organismos con cuerpo blando⁹. Para la alimentación de las especies por ingestión de líquido o para algunos consumidores invertebrados que intensivo dilacerar su comida antes de la ingestión, como anfípodos, identificación visual de especies de presas en contenido estomacal es imposible¹⁰. Debido a estas limitaciones, el análisis molecular ofrece una alternativa prometedora.

Los análisis moleculares se han convertido en una herramienta común que permiten la detección de la presa rápida y precisa en el contenido estomacal. La gama de tales técnicas es diversa: estrategias basadas en anticuerpos monoclonales o reacciones en cadena de polimerasa (polimerización en cadena) se utilizan a menudo, debido a su alta especificidad y sensibilidad¹¹. El desarrollo de nuevos anticuerpos monoclonales es intensivo en tiempo y costo, por lo tanto, la aplicación de otras técnicas moleculares es más útil cuando los anticuerpos ya no existen¹¹. Otro método común es la amplificación de regiones del ácido desoxirribonucleico (ADN), como el ácido ribonucleico ribosomal (ARN) genes presentes en la mayoría de las especies, usando la cartilla universal establece^12,13. Cuando se utiliza esta técnica, a menudo no es posible identificar toda la gama de organismos presa dentro de fuentes mixtas de ADN¹⁴. Un enfoque eficaz para evitar tal inconveniente es usar primer grupo-específicas para el análisis de contenido intestinal genéticos. Diseñado para amplificar sólo regiones de ADN de grupos particulares y excluyen otras especies^15,16, cebadores específicos de Grupo permiten la identificación de organismos presa en el nivel taxonómico de los grupos especificados sin análisis secundario de tiempo y costosa. Sin embargo, como todo análisis de contenido de la tripa, tales análisis proporcionan sólo una instantánea del comportamiento alimentario. Por lo tanto, la combinación de análisis de contenido intestinal molecular con análisis de marcadores naturales integración de tiempo (por ejemplo, los isótopos estables) se considera beneficioso^1,2.

Aquí, describimos un método detallado para las investigaciones basadas en la PCR de las interacciones depredador-presa utilizando conjuntos de primer grupo-específicas para las regiones de ADN (ADNr) ribosomales nucleares para ser combinado con análisis de isótopos estables de la misma muestra. Describimos la detección de ADN de grupos de presas solo mediante electroforesis en gel de agarosa. Además, se presenta una oportunidad para mayores posteriores análisis de productos PCR de tales cartillas de Grupo-específicas aplicables siempre que se requiera una mayor resolución taxonómica que la especificidad de los cebadores. Porque la sola DNA trenzada (ssDNA) fragmentos de conformaciones terciaria de forma que se determinaron por su secuencia primaria¹⁷, pequeñas variaciones en los fragmentos amplificados por tales cebadores específicos de grupo conducen a cambios conformacionales. Estos cambios pueden detectarse por análisis de polimorfismo (SSCP) conformación de cadena única con geles de poliacrilamida^17,18, lo que permite una identificación más precisa de organismos presa (hasta el nivel de especie).

Mientras que la electroforesis en gel de agarosa es una herramienta común y barata para visualizar fragmentos de ADN y determinar su longitud aproximada¹⁹, la resolución depende de la cantidad de ADN y el tinción colorante usado²⁰. Por lo general, la visualización es sencillo cuando se trabaja con muestras de ADN puras, pero potencialmente bajas cantidades de presas DNA en el contenido estomacal de los consumidores puede complicar el marcador de resultados de electroforesis de gel de agarosa. Todavía, este método de detección es factible para detectar un bajo número de muestras al consumidor desde el campo uno o presa de algunos grupos, pero complicación en el marcador hace que la proyección de un gran número de muestras por múltiples presas taxones extremadamente tiempo intensivo y así impracticable. Un método de detección más sensible es el análisis automatizado de fragmentos por electroforesis capilar, que además permite la determinación de la longitud exacta de fragmentos²¹. Varios microsatélites en estudios han demostrado que mediante el uso de diferentes tintes fluorescentes como las etiquetas, es posible detectar y determinar diferentes fragmentos de longitud comparable por fragmento automatizado análisis^{22,23, 24}. Por lo tanto, también presentamos un protocolo detallado para paralelo detección de ADN de presas múltiples grupos mediante PCR con conjuntos de etiquetado específico de grupo primer y detección mediante análisis del fragmento automatizado con un secuenciador automatizado. Además, presentamos los resultados de un estudio de caso que demuestra que la detección del ADN de la presa mediante el análisis del fragmento automatizado es un enfoque que también permite una cuantificación relativa de la presa ingerida.

Protocol

1. recoger los macroinvertebrados en el campo y preparar las muestras para los análisis de contenido intestinal genéticos. Colecta de macroinvertebrados en cada sitio, ordenar a individuos de especies de consumo de interés en tubos individuales y congelarlas directamente en nitrógeno líquido o hielo seco para evitar la separación de la tripa y la degradación de DNA. Nota: Evite guardar las muestras en alcohol, porque algunos macroinvertebrados suelen regurgitar antes de que el alcohol mata. …

Representative Results

Hemos utilizado con éxito pasos descritos en este protocolo para el análisis de la dieta en diferentes estudios. En esta sección, presentamos ejemplos que describe la aplicabilidad de las distintas secciones del protocolo. Por ejemplo, para demostrar la efectividad de los sistemas de primer grupo-específica establecida por los autores28 y el potencial de mayores aguas abajo análisis de productos PCR …

Discussion

Aquí, presentamos un método fácil y costo-eficiente para la polimerización en cadena-basado determinación de interacciones depredador-presa de muestras de campo a través de cartillas de Grupo-específicas para las regiones de ADNr, que pueden combinarse con otros análisis no moleculares de las mismas muestras. Sin embargo, hay varios pasos críticos dentro del protocolo. En primer lugar, es esencial asegurar la especificidad de los cebadores utilizados. En segundo lugar, es crucial para evitar la contaminación y …

Materials

liquid nitrogen	Any	NA	For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock	Any	NA	For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope	Any	NA	Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes	Any	NA	To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7	Bioform	B40d	This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5	Bioform	B40b	This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel	Any	NA
Lab scale	Any	NA	Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	Any	NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml	VWR	211-2165	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml	VWR	211-2164	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	carlroth	8043.1	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	carlroth	4360.1	For extraction of DNA
Proteinase K lyophil.	carlroth	7528.1	Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm	Quiagen	69989	For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	Any	NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a.	Any	NA
Water Molecular biology grade (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates	VWR Peqlab	732-2879	Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes	VWR Peqlab	732-3223	Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose	Peqlab	35-1020	Used for gel electrophoresis.
Microwave	Any	NA
Conical flask	Any	NA
Measuring cylinder	Any	NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth	Any	NA	For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002	Life Technologies	NA
Ethidium bromide solution 1 %	carlroth	2218.1	Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide	carlroth	6749.1	Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose	carlroth	4621.1	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system	Any	NA	To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate	carlroth	9592.2	For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	carlroth	23.67.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker	Any	NA
RC 10 Digital chiller	VWR	462-0138	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate	VWR	730-0261	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate	VWR	730-0260	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers	VWR	730-0262	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth	VWR	730-0294	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform	Any	NA	For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS)	AB Sciex	608082	For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate	Costar	6551	For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer	AB Sciex	608012	For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI	AB Sciex	608010	For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System	Beckman Coulter	NA	For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	To analyze results of automated fragment analyses.