Laboratorium Protocol voor genetische Analyses van de inhoud van de Gut van aquatische Macroinvertebrates gebruiken groepsspecifieke rDNA Primers

Summary

Meest voorkomende analyses van de inhoud van de darm van macroinvertebrates zijn visueel. Waarbij intensieve kennis over morfologische diversiteit van organismen van de prooi, ze missen zachte lijf prooi en, als gevolg van de sterke trimventilatoren van de prooi, zijn bijna onmogelijk voor sommige organismen, met inbegrip van vlokreeftjes. Wij bieden gedetailleerde, roman genetische methoden voor macroinvertebrate ten prooi identificatie in het dieet van vlokreeftjes.

Abstract

Analyseren van voedsel webs is essentieel voor een beter begrip van de ecosystemen. Bijvoorbeeld kunnen voedselweb interacties ondergaan grote veranderingen veroorzaakt door de invasie van uitheemse soorten. Een nauwkeurige identificatie van veld van predator en prooi interacties is echter moeilijk in veel gevallen. Deze analyses zijn vaak gebaseerd op een visuele beoordeling van de inhoud van de darm of de analyse van stabiele isotopenverhoudingen (δ¹⁵N en δ¹³C). Dergelijke methoden vereisen uitgebreide kennis over, respectievelijk, de diversiteit van de morfologische of isotopische handtekening van individuele prooi organismen, wat leidt tot hindernissen in de nauwkeurige identificatie van prooi organismen. Zachte lijf prooi organismen, onderschatten visuele gut inhoud analyses vooral omdat maceratie, opname en vertering van prooi organismen identificatie van specifieke soorten moeilijk maken. Vandaar, polymerase kettingreactie (PCR) gebaseerde strategieën, bijvoorbeeld het gebruik van een groepspecifiek primer ingesteld, bieden een krachtig hulpmiddel voor het onderzoek van voedselweb interacties. Hier beschrijven we gedetailleerde protocollen om te onderzoeken van de darm-inhoud van macroinvertebrate consumenten uit het veld met behulp van groepsspecifieke primer sets voor nucleaire ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA). DNA kan worden geëxtraheerd hetzij uit hele monsters (in het geval van kleine taxa) of uit de inhoud van de darm van specimens verzameld in het veld. Aanwezigheid en functionele efficiëntie van de DNA-sjablonen moeten worden bevestigd vanuit de geteste persoon met behulp van universele primer ingesteld gericht op de respectieve subeenheid van DNA. We laten ook zien dat verbruikte prooi kan worden bepaald verder tot op het niveau van soorten via PCR met ongewijzigde groepsspecifieke inleidingen gecombineerd met latere enkele streng conformatie polymorfisme (SSCP) analyses met behulp van polyacrylamide gels. Bovendien laten we zien dat het gebruik van verschillende fluorescente kleurstoffen als labels kan parallelle screening voor DNA-fragmenten van verschillende prooi groepen uit meerdere inhoud monsters van de darm via geautomatiseerde fragment analyse.

Introduction

Predator en prooi interacties, die de meerderheid van de trofische interacties en voedselweb dynamiek vormen, zijn belangrijke aspecten te karakteriseren de fluxen van materie en energie in de hele voedsel webs binnen en tussen de ecosystemen, die behoort tot de belangrijkste doelstellingen van ecologie ¹. de bepaling van de bron en stroom van koolstof en voedingsstoffen is het bevorderen van het inzicht in ecologische verbinding tussen ecosystemen². Echter, ecosystemen, zoals rivieren en hun stroomgebieden, zijn niet alleen gekoppeld door stromen van organisch materiaal en organische voedingsstoffen, maar ook door de bewegingen van organismen³. Dus, habitat wijzigingen onderbreking van de stroom van middelen die een link van deze systemen kunnen sterk veranderen de voedsel vliezen van beide ecosystemen, niet alleen rechtstreeks maar ook onrechtstreeks door het veranderen van de respectieve samenstelling van predator en prooi Gemeenschappen. Bijvoorbeeld, zijn wijzigingen van voedsel webs aangetoond moet worden gekoppeld aan de bewegingen van één predator soorten (bijvoorbeeld, regenboogforel)⁴. Dergelijke wijzigingen worden potentieel biodiversiteit en het functioneren van aquatische ecosystemen bedreigen. Daarom is analyseren van predator en prooi interacties in het veld essentieel voor het bepalen van de invloed van de mens veroorzaakte veranderingen in het milieu, zoals water managementpraktijken, op de inheemse biodiversiteit van aquatische ecosystemen.

Aangezien het bijhouden van trofische verbanden moeilijk in complexe systemen is, zijn verschillende benaderingen vastgesteld waarmee de beoordeling van het voederen van interacties in het veld⁵. Traditioneel, onderzoeken van het voederen van interacties in het veld zijn gebaseerd op visuele identificatie van prooi blijft in ontleed lef en vereist een uitgebreide kennis over morfologische prooi diversiteit. Visuele gut inhoud analyses hebben verstrekt inzicht in het gebruik van de hulpbronnen van verschillende groepen consumenten (bijvoorbeeld seizoensgebonden variatie in de voeding van kreeft⁶ en vis^7,8 of voeding voorkeuren van roeipootkreeften). Echter het fysieke proces van spijsvertering visuele gut inhoud analyses bemoeilijkt en mist meestal zacht carrosserie prooi-organismen⁹. Voor soorten voeden door vloeibare inslikken of voor sommige ongewervelde consumenten die intensief Vermaal hun voedsel voor inslikken, zoals vlokreeftjes, is visuele identificatie van prooi soorten in de inhoud van de darm niet onmogelijk¹⁰. Vanwege deze beperkingen biedt moleculaire analyse een veelbelovend alternatief.

Moleculair analyses zijn geworden een gemeenschappelijk instrument waardoor de prooi van snelle en nauwkeurige detectie in de inhoud van de darm. Het bereik van dergelijke technieken is divers: strategieën op basis van monoclonal antilichamen of polymerase-kettingreactie (PCR) worden vaak gebruikt, vanwege hun hoge gevoeligheid en specificiteit¹¹. De ontwikkeling van nieuwe monoclonal antilichamen is tijd – en kostenintensieve, daarom de toepassing van andere moleculaire technieken is nuttiger wanneer antilichamen¹¹niet reeds bestaan. Een andere gemeenschappelijke benadering is de versterking van de regio’s van deoxyribonucleic acid (DNA), zoals ribosomal RNA acid (RNA) genen aanwezig zijn in de meeste soorten, met behulp van universele primer ingesteld^12,,¹³. Wanneer u deze techniek gebruikt, is het vaak niet mogelijk om te identificeren van het hele scala van prooi organismen in gemengde bronnen van DNA¹⁴. Een effectieve aanpak om te voorkomen dat de teruggave is groepsspecifieke primer gebruiken wordt ingesteld voor genetische gut inhoud analyses. Ontworpen om te versterken alleen DNA regio’s van bijzondere doelgroepen en uitsluiten van alle andere soorten^15,16, inschakelen groepsspecifieke inleidingen identificatie van prooi organismen op het taxonomische niveau van de opgegeven groepen zonder tijd – en kostenintensieve secundaire analyses. Zoals alle inhoudsanalyse gut, evenwel dergelijke analyses slechts een momentopname van het voederen van gedrag. Daarom, moleculaire gut inhoud analyses combineren met analyses van integratie van de tijd natuurlijke traceurs (bijvoorbeeld stabiele isotopen) wordt beschouwd als gunstig^1,2.

Hier beschrijven we een gedetailleerde methode voor PCR-gebaseerde onderzoek van predator en prooi interacties met behulp van groepsspecifieke primer sets voor nucleaire ribosomal DNA (rDNA) regio’s worden gecombineerd met stabiele isotoop analyses van het hetzelfde model. We beschrijven de opsporing van het DNA van één prooi groepen via agarose gelelektroforese. Daarnaast presenteren wij gelegenheid voor verder stroomafwaarts analyses van PCR producten van dergelijke groepsspecifieke inleidingen die van toepassing zijn wanneer een hogere taxonomische resolutie dan de inleidingen specificiteit vereist is. Omdat één gestrande DNA (ssDNA) tertiaire conformaties vorm die wordt bepaald door hun primaire reeks^{17 fragmenten}, leiden kleine variaties in fragmenten versterkt door dergelijke groepsspecifieke inleidingen tot conformationele veranderingen. Dergelijke veranderingen kunnen worden gedetecteerd door enkele streng conformatie polymorfisme (SSCP) analyses met polyacrylamide gels^17,18, waardoor een meer nauwkeurige identificatie van prooi organismen (tot op het niveau van de soorten).

Terwijl de Elektroforese van het gel van de agarose is een gemeenschappelijk en goedkope tool om DNA-fragmenten te visualiseren en bepalen hun lengte¹⁹, de resolutie is afhankelijk van de hoeveelheid DNA en de kleuring kleurstof gebruikt²⁰. Meestal de visualisatie is ongecompliceerd bij het werken met zuivere DNA-monsters, maar potentieel lage bedragen van havikachtigen DNA in de inhoud van de darm van de consument kan bemoeilijken het scoren van agarose gel elektroforese resultaten. Nog, deze detectiemethode is haalbaar is om het scherm van een laag aantal consument exemplaren van het veld voor een of een paar prooi groepen, maar complicatie in het scoren maakt de screening van een groot aantal monsters voor meerdere prooi taxa tijd uiterst intensieve en dus onuitvoerbaar. Een meer gevoelige detectiemethode is de geautomatiseerde analyse van fragmenten via capillaire elektroforese, waarmee bovendien de bepaling van de exacte lengte van fragmenten²¹. Verschillende microsatelliet gebaseerd studies hebben aangetoond dat met behulp van verschillende fluorescente kleurstoffen als labels, het mogelijk is om te ontdekken en bepalen verschillende fragmenten van vergelijkbare lengte door geautomatiseerde fragment analyse^{22,23, 24}. Daarom ook presenteren we een gedetailleerd protocol voor parallelle opsporing van DNA van meerdere prooi groepen met behulp van PCR met gelabelde groepsspecifieke primer sets en detectie via geautomatiseerde fragment analyse met een geautomatiseerde sequencer. Daarnaast presenteren wij de resultaten van een case studie waaruit blijkt dat de detectie van prooi DNA via geautomatiseerde fragment analyse een aanpak waarmee ook een relatieve kwantificering van geconsumeerde prooi.

Protocol

1. verzamelen van Macroinvertebrates uit het veld en voorbereiding van de monsters voor genetische Gut inhoud Analyses. Collect macroinvertebrates op elke site, uitzoeken van personen van belang in één buizen soorten consument en bevriezen ze rechtstreeks in vloeibare stikstof of droog ijs gut opruiming en afbraak van DNA te voorkomen. Opmerking: Vermijd monsters opslaan in alcohol, omdat sommige macroinvertebrates neiging om uitbraken voordat de alcohol hen doodt. Alleen gebruik mak…

Representative Results

We stappen die in dit protocol voor dieet analyses binnen verschillende studies beschreven voor het met succes gebruikt. In dit gedeelte geven we voorbeelden met een beschrijving van de toepasbaarheid van de verschillende secties van het protocol. Als voorbeeld, om aan te tonen de effectiviteit van groepsspecifieke primer sets opgericht door de auteurs28 en het potentieel van verder stroomafwaarts analyse…

Discussion

Hier presenteren we een gemakkelijke en kosten-efficiënte methode voor PCR-gebaseerde bepaling van predator en prooi interacties van veldmonsters via groepsspecifieke inleidingen voor rDNA regio’s, die kunnen worden gecombineerd met andere niet-moleculaire analyses van de dezelfde specimens. Er zijn echter verschillende kritische stappen binnen het protocol. Ten eerste, het verzekeren van de specificiteit van de inleidingen gebruikt is essentieel. Ten tweede, is het voorkomen van verontreiniging en verlies van gut inhou…

Materials

liquid nitrogen	Any	NA	For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock	Any	NA	For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope	Any	NA	Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes	Any	NA	To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7	Bioform	B40d	This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5	Bioform	B40b	This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel	Any	NA
Lab scale	Any	NA	Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	Any	NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml	VWR	211-2165	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml	VWR	211-2164	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	carlroth	8043.1	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	carlroth	4360.1	For extraction of DNA
Proteinase K lyophil.	carlroth	7528.1	Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm	Quiagen	69989	For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	Any	NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a.	Any	NA
Water Molecular biology grade (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates	VWR Peqlab	732-2879	Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes	VWR Peqlab	732-3223	Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose	Peqlab	35-1020	Used for gel electrophoresis.
Microwave	Any	NA
Conical flask	Any	NA
Measuring cylinder	Any	NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth	Any	NA	For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002	Life Technologies	NA
Ethidium bromide solution 1 %	carlroth	2218.1	Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide	carlroth	6749.1	Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose	carlroth	4621.1	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system	Any	NA	To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate	carlroth	9592.2	For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	carlroth	23.67.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker	Any	NA
RC 10 Digital chiller	VWR	462-0138	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate	VWR	730-0261	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate	VWR	730-0260	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers	VWR	730-0262	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth	VWR	730-0294	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform	Any	NA	For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS)	AB Sciex	608082	For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate	Costar	6551	For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer	AB Sciex	608012	For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI	AB Sciex	608010	For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System	Beckman Coulter	NA	For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	To analyze results of automated fragment analyses.