Laborprotokoll für genetische Darm Inhaltsanalysen der aquatischen Makroinvertebraten Using gruppenspezifische rDNA Primer

Summary

Am häufigsten Darm Inhaltsanalysen der Makroinvertebraten sind visuell. Intensive Kenntnisse über morphologische Vielfalt der Beute Organismen erfordern, sie vermissen weichen vollmundigen Beute und durch starke Zerkleinerung von Beute, sind fast unmöglich für einige Organismen, einschließlich Amphipoden. Wir bieten detaillierte, neuartigen gentechnische Ansätze für Soisgrabenbaches Identifikation in der Ernährung der Amphipoden Beute.

Abstract

Analyse von Nahrungsketten ist essentiell für ein besseres Verständnis von Ökosystemen. Nahrungsnetz-Interaktionen können zum Beispiel schwere Veränderungen verursacht durch die Invasion der nicht heimischer Arten unterziehen. Eine genaue Identifizierung der Feld-Räuber-Beute-Interaktionen ist jedoch in vielen Fällen schwierig. Diese Analysen basieren häufig auf eine visuelle Beurteilung der Darm Inhalt oder die Analyse der stabile Isotopenverhältnisse (δ¹⁵N und δ-¹³C). Solche Methoden erfordern umfassende Kenntnisse über, bzw. morphologische Vielfalt oder isotopische Unterzeichnung von einzelnen Beute Organismen, zu Hindernissen bei der genauen Identifizierung von Beute Organismen. Visuelle Darm Inhaltsanalysen unterschätzen besonders weichen vollmundigen Beute Organismen, weil Mazeration, Nahrungsaufnahme und Verdauung der Beute Organismen Identifizierung von spezifischen Arten erschweren. Daher Polymerase-Kettenreaktion (PCR) basierte Strategien, zum Beispiel die Verwendung von gruppenspezifischen Primer setzt, bieten ein leistungsfähiges Werkzeug für die Untersuchung von Nahrungsnetz-Interaktionen. Hier beschreiben wir ausführliche Protokolle zur Untersuchung der Darminhalt der Verbraucher denkt vom Feld mit gruppenspezifischen Primer-Sets für nukleare ribosomale Desoxyribonukleinsäure (rDNA). DNA kann entweder vom ganzen Exemplare (bei kleinen Taxa) extrahiert oder aus Darminhalt im Feld gesammelten Exemplare. Präsenz und Funktionstüchtigkeit der DNA Vorlagen direkt von der getesteten Person bestätigt werden müssen mit universal Primer setzt gezielt die jeweiligen Untereinheit der DNA. Wir zeigen auch, dass verbrauchte Beute bestimmt werden kann, weiter bis auf Artniveau über PCR mit unveränderten gruppenspezifischen Primer, verbunden mit nachfolgenden Einzelstrang Konformation Polymorphismus (SSCP) Analysen mittels Polyacrylamid-Gele. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Verwendung von unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen als Etiketten parallel Screening für DNA-Fragmente unterschiedlicher Beute Gruppen aus mehreren Darm Inhalt Proben über automatisierte Fragment Analyse ermöglicht.

Introduction

Räuber-Beute-Interaktionen, die die Mehrheit der trophischen Interaktionen und Nahrungsnetz Dynamik darstellen, sind wichtige Aspekte charakterisieren die Fluten von Materie und Energie im gesamten Nahrungsnetze innerhalb und zwischen den Ökosystemen, die eines der wichtigsten Ziele der Ökologie ist ¹. die Bestimmung der Quelle und Fluss von Kohlenstoff und Nährstoffen fördert das Verständnis der ökologischen Vernetzung zwischen Ökosystemen². Ökosysteme, wie Flüsse und ihre Einzugsgebiete werden jedoch nicht nur durch Fluten von organischen Stoffen und Nährstoffen, sondern auch durch die Bewegungen der Organismen³verknüpft. So können Lebensraum Änderungen unterbrechen die Ressourcen, die diese Systeme verbinden stark Nahrungsketten der beiden Ökosysteme nicht nur direkt, sondern indirekt auch ändern, indem Änderung der jeweiligen Zusammensetzung der Räuber-Beute-Gemeinschaften. Zum Beispiel wurden Änderungen der Nahrungsnetze gezeigt, um die Bewegungen der einzelnen Raubtier Arten (z.B., Regenbogenforelle)⁴verknüpft werden. Solche Veränderungen drohen möglicherweise biologische Vielfalt und das funktionieren aquatischer Ökosysteme. Daher ist es wichtig, die Auswirkungen von Menschen verursachten Umweltveränderungen, wie Wasser-Management-Praktiken, auf die Einheimischen Biodiversität aquatischer Ökosysteme, Räuber-Beute-Interaktionen im Bereich Analyse.

Da tracking trophische Beziehungen schwierig in komplexen Systemen, entstanden mehrere Ansätze, die es ermöglichen die Beurteilung der Fütterung Interaktionen in Feld⁵. Traditionell, Untersuchungen der Fütterung Interaktionen im Bereich basieren auf visuelle Identifizierung der Beute bleibt in seziert Mut und erfordern ein umfangreiches Wissen über die Vielfalt der morphologischen Beute. Visuelle Darm Inhaltsanalysen haben Einblicke in die Nutzung der Ressourcen von mehreren Gruppen von Verbrauchern (z. B. jahreszeitliche Variation in der Ernährung der Hummer⁶ und Fisch^7,8 oder Fütterung Präferenzen von Copepoden) zur Verfügung gestellt. Jedoch der physikalischen Prozess der Verdauung erschwert die visuelle Darm Inhaltsanalysen und in der Regel weichen vollmundigen Beute-Organismen⁹vermisst. Für die Arten Fütterung durch flüssige Einnahme oder für einige wirbellose Verbraucher, die ihre Nahrung vor der Einnahme, wie Amphipoden, intensiv zerkleinern ist visuelle Identifizierung von Beutetieren im Darminhalt unmöglich¹⁰. Aufgrund dieser Einschränkungen bietet die molekulare Analyse eine viel versprechende Alternative.

Molekulare Analysen haben jetzt ein gemeinsames Instrument ermöglicht schnelle und präzise Beute Nachweis im Darminhalt geworden. Solche Techniken sind vielfältig: Strategien basierend auf monoklonalen Antikörpern oder Polymerase-Kettenreaktion (PCR) werden häufig verwendet, wegen ihrer hohen Spezifität und Sensitivität¹¹. Die Entwicklung von neuen monoklonalen Antikörpern ist Zeit- und kostenintensiv, daher die Anwendung der anderen molekularen Techniken ist nützlich, wenn Antikörper¹¹nicht bereits vorhanden sind. Eine andere Möglichkeit ist die Verstärkung der Regionen der Desoxyribonukleinsäure (DNA), wie ribosomale Ribonukleinsäure (RNA) Gene bei den meisten Arten, universelle Grundierung mit^12,13. Wenn Sie diese Technik verwenden, ist es oft nicht möglich, das gesamte Spektrum der Beute Organismen in verschiedenen Quellen von DNA-¹⁴zu identifizieren. Ein effektiver Ansatz, diesen Nachteil zu vermeiden setzt gruppenspezifischen Primer verwenden für genetische Darm Inhaltsanalysen. Entwickelt, um nur DNA-Abschnitte bestimmter Zielgruppen zu verstärken und schließen alle anderen Arten^15,16, ermöglichen gruppenspezifischen Primer Beute Organismen auf der taxonomischen Ebene der angegebenen Gruppen ohne Zeit- und kostenintensive Sekundäranalysen. Wie alle Inhaltsanalyse ausnehmen, bieten solche Analysen jedoch nur eine Momentaufnahme der Fressverhalten. Daher gilt als Kombination von molekularen Darm Inhaltsanalysen mit Analysen von Zeit-Integration von natürliche Tracer (z. B. stabile Isotope) vorteilhaft^1,2.

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode für PCR-basierte Untersuchungen der Räuber-Beute-Interaktionen mit gruppenspezifischen Primer-Sets für nukleare ribosomalen DNA (rDNA) Regionen mit stabilen Isotopen-Analysen der gleichen Probe kombiniert werden. Wir beschreiben den Nachweis der DNA des einzigen Beute Gruppen durch Agarose-Gelelektrophorese. Darüber hinaus präsentieren wir eine Gelegenheit für weitere nachgelagerte Analysen der PCR-Produkte von solchen gruppenspezifischen Primer anwendbar, wenn eine höhere taxonomische Auflösung als die Primer Spezifität erforderlich ist. Da einzelne stranded DNA (SsDNA) Form tertiären Konformationen, die durch ihre primäre Sequenz¹⁷bestimmt sind Fragmente, führen kleine Variationen in Fragmenten, die durch solche gruppenspezifischen Primer verstärkt zu Konformationsänderungen. Solche Änderungen können durch Einzelstrang Konformation Polymorphismus (SSCP) Analysen mit Polyacrylamid-Gele^17,18, ermöglichen eine genauere Identifizierung der Beute Organismen (bis auf Artniveau) erkannt werden.

Während Agarose-Gelelektrophorese ist ein gemeinsamer und preiswerte Werkzeug, um DNA-Fragmente zu visualisieren und bestimmen ihre ungefähre Länge¹⁹, die Auflösung hängt von der DNA und der Färbung Farbstoff verwendet²⁰. In der Regel die Visualisierung ist geradlinig beim Arbeiten mit reiner DNA-Proben, aber potenziell geringe Mengen an Beute DNA in den Darminhalt der Verbraucher kann das Punktesystem von Agarose-Gel-Elektrophorese-Ergebnisse erschweren. Dennoch diese Nachweismethode ist möglich, eine geringe Anzahl von Verbraucher-Proben aus dem Bereich für einen Bildschirm oder ein paar Beute Gruppen, aber Komplikation in der Wertung macht das Screening eine hohe Anzahl von Proben für mehrere Beute Taxa sehr Zeit intensiv und damit nicht praktikabel. Ein empfindlicher Nachweisverfahren ist die automatisierte Analyse von Fragmenten über Kapillarelektrophorese, wodurch zusätzlich die Bestimmung der genauen Länge des Fragmente²¹. Mehreren Mikrosatelliten basierten Studien haben gezeigt, dass mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen als Etiketten, es möglich ist zu erkennen und zu bestimmen, verschiedene Fragmente von vergleichbarer Länge durch automatisierte Fragment Analyse^{22,23, 24}. Daher stellen wir auch ein detailliertes Protokoll für parallelen Detektion von DNA aus mehreren Beute Gruppen mittels PCR mit beschrifteten gruppenspezifischen Primer und Erkennung über automatisierte Fragment Analyse mit einem automatisierten Sequenzer. Darüber hinaus präsentieren wir die Ergebnisse aus einer Fallstudie demonstriert, dass die Erkennung von Beute DNA über automatisierte Fragment Analyse Ansatz ermöglicht auch eine relative Quantifizierung von angesaugte Beute.

Protocol

1. Makroinvertebraten aus dem Feld zu sammeln und bereiten die Proben für genetische Darm Inhaltsanalysen. Sammeln Makroinvertebraten an jedem Standort sortieren Individuen Verbraucher Art von Interesse in einzelne Rohre und direkt Einfrieren in flüssigem Stickstoff oder Trockeneis, Darm-Clearance und Abbau der DNA zu verhindern. Hinweis: Vermeiden Sie Proben in Alkohol, zu speichern, weil einige Makroinvertebraten Erbrechen tendenziell vor der Alkohol tötet. Verwenden Sie nur den M…

Representative Results

Wir haben erfolgreich in diesem Protokoll für Diät-Analysen im Rahmen verschiedener Studien beschriebenen Schritte. In diesem Abschnitt zeigen wir Beispiele beschreiben die Anwendbarkeit der einzelnen Abschnitte des Protokolls. Als Beispiel um die Wirksamkeit von gruppenspezifischen Primer-Sets von der Autoren-28 und das Potenzial der nachgeschalteten Analysen der PCR-Produkte von SSCP Analysen, gegrün…

Discussion

Hier präsentieren wir Ihnen eine einfache und kostengünstige Methode für PCR-basierte Bestimmung der Räuber-Beute-Interaktionen von Feldproben über gruppenspezifischen Primer für rDNA Regionen, die mit anderen nicht-molekulare Analysen der gleichen Proben kombiniert werden können. Allerdings gibt es einige wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls. Erstens ist es wichtig, versichert die Spezifität der Primer verwendet. Zweitens ist es wichtig zur Vermeidung von Verschmutzung und Verlust der Darm Inhalt Material …

Materials

liquid nitrogen	Any	NA	For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock	Any	NA	For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope	Any	NA	Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes	Any	NA	To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7	Bioform	B40d	This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5	Bioform	B40b	This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel	Any	NA
Lab scale	Any	NA	Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	Any	NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml	VWR	211-2165	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml	VWR	211-2164	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	carlroth	8043.1	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	carlroth	4360.1	For extraction of DNA
Proteinase K lyophil.	carlroth	7528.1	Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm	Quiagen	69989	For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	Any	NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a.	Any	NA
Water Molecular biology grade (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates	VWR Peqlab	732-2879	Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes	VWR Peqlab	732-3223	Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose	Peqlab	35-1020	Used for gel electrophoresis.
Microwave	Any	NA
Conical flask	Any	NA
Measuring cylinder	Any	NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth	Any	NA	For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002	Life Technologies	NA
Ethidium bromide solution 1 %	carlroth	2218.1	Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide	carlroth	6749.1	Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose	carlroth	4621.1	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system	Any	NA	To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate	carlroth	9592.2	For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	carlroth	23.67.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker	Any	NA
RC 10 Digital chiller	VWR	462-0138	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate	VWR	730-0261	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate	VWR	730-0260	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers	VWR	730-0262	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth	VWR	730-0294	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform	Any	NA	For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS)	AB Sciex	608082	For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate	Costar	6551	For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer	AB Sciex	608012	For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI	AB Sciex	608010	For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System	Beckman Coulter	NA	For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	To analyze results of automated fragment analyses.