Лаборатория протокол для генетических кишки содержание анализа водных макробеспозвоночных использование конкретных групп рДНК грунтовки

Summary

Наиболее распространенными кишки контент анализ мелководьях визуальные. Требующей интенсивных знаний о морфологическое разнообразие хищных организмов, они пропустите мягкой здоровых добычу и, из-за сильного измельчение хищных, почти невозможным для некоторых организмов, в том числе амфиподы. Мы предоставляем подробные, Роман генетических подходов для macroinvertebrate добычу идентификации в рационе амфиподы.

Abstract

Анализ пищевых сетей имеет важное значение для более глубокого понимания экосистем. Например пищевой сети взаимодействия могут пройти серьезные изменения, вызванные вторжения неместных видов. Однако во многих случаях трудно точной идентификации поля хищник жертва взаимодействий. Часто эти анализы основаны на визуальная оценка содержимого кишечника или анализ соотношения стабильных изотопов (δ¹⁵N и δ¹³C). Такие методы требуют всесторонних знаний о, соответственно, морфологическая разнообразия или изотопном подпись от отдельных хищных организмов, ведущих к препятствий в точной идентификации хищных организмов. Визуальные кишки содержание анализа особенно недооценивать мягкой здоровых хищных организмов, потому что мацерации, проглатывание и пищеварение хищных организмов затрудняют выявление конкретных видов. Следовательно, полимеразная цепная реакция (ПЦР) на основе стратегий, например использование группы специфического праймера устанавливает, обеспечивают мощный инструмент для исследования пищевой сети взаимодействия. Здесь мы описываем подробные протоколы для расследования содержимое кишки macroinvertebrate потребителей от поля, используя наборы группа специфического праймера для ядерных рибосомных дезоксирибонуклеиновой кислоты (рДНК). ДНК может быть извлечено из всей образцов (в случае малых таксонов) или из содержимого кишечника образцов, собранных в поле. Присутствие и функциональной эффективности ДНК шаблонов необходимо подтвердить непосредственно из протестированных личности с использованием универсальная грунтовка задает ориентации соответствующих субъединицы ДНК. Мы также продемонстрировать, что потребляемая добычей могут быть определены, далее до уровня видов через PCR с неизмененной группа специфические праймеры в сочетании с последующей одиночной стренги конформации полиморфизм (SSCP) анализа с использованием полиакриламидных гелей. Кроме того мы показываем, что использование различных флуоресцентных красителей как этикетки позволяет параллельный скрининг для фрагментов ДНК различных хищных групп из нескольких образцов контента кишки через анализ автоматизированной фрагмент.

Introduction

Хищник жертва взаимодействий, которые составляют большинство трофических взаимодействий и пищевой сети динамики, являются ключевыми для характеристики потоков материи и энергии в пищевых цепях внутри и между экосистемы, которая является одной из основных целей экологии ¹. Определение источника и потоков углерода и питательных веществ углубление понимания экологических связи между экосистем². Однако экосистем, таких как реки и их водосборных бассейнов, связаны не только потоков органического вещества и питательных веществ, но и движениями организмов³. Таким образом изменения среды обитания, прерывания потока ресурсов, которые связывают этих систем может сильно изменить пищевых цепях как экосистем, не только непосредственно, но также косвенно, изменяя состав соответствующих общин хищник жертва. Например изменения трофических было показано, быть связаны с движениями хищника одного вида (например, радужная форель)⁴. Такие изменения потенциально угрожает биоразнообразию и функционирование водных экосистем. Таким образом анализируя хищник жертва взаимодействия в области важно определить воздействие антропогенных изменений окружающей среды, например практики водопользования, на родной биоразнообразия водных экосистем.

Поскольку отслеживание трофических связей является сложным в сложных системах, несколько подходов были созданы, которые позволяют оценку кормления взаимодействий в поле⁵. Традиционно исследования взаимодействия в области кормления основаны на визуальной идентификации останков добычу в расчлененных кишки и требуют обширные знания о разнообразии морфологической добычу. Визуальные кишки содержание анализа оказали идеи использования ресурсов нескольких групп потребителей (например, сезонные изменения в диете омаров⁶ и рыбы^7,8 или кормления предпочтений копепод). Однако физический процесс пищеварения затрудняет анализ содержания визуальные кишки и обычно пропускает мягкой здоровых хищных организмов⁹. Для видов кормления при попадании жидкости или некоторых беспозвоночных потребителей, которые интенсивно измельчения их пищи до приема пищи, как амфиподы визуальная идентификация хищников в кишечнике содержимое является невозможным¹⁰. Из-за этих ограничений молекулярный анализ обеспечивает перспективные альтернативы.

Молекулярный анализ теперь стали общий инструмент, позволяющий добычу быстрого и точного обнаружения в кишечнике содержимое. Спектр таких методов разнообразен: стратегии, основанные на полимеразной цепной реакции (ПЦР) или моноклональные антитела часто используются, из-за их высокой чувствительности и специфичности¹¹. Развитие новых моноклональных антител требует больших затрат времени и стоимости, поэтому, применение других методов молекулярной более полезным, когда антитела уже не существуют¹¹. Другой распространенный подход является усиление регионов дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), как в большинстве видов, используя универсальный грунт генов рибосомной рибонуклеиновой кислоты (РНК) устанавливает^12,13. При использовании этого метода, это часто не позволяет выявить целый ряд хищных организмов в рамках смешанных источников ДНК¹⁴. Эффективный подход к избежать такой недостаток — использовать группы специфического праймера наборы для анализа генетических кишки содержание. Предназначен для усиления только ДНК регионах конкретных целевых групп и исключения всех других видов^15,16, Группа специфические праймеры позволяют идентификацию хищных организмов на таксономический уровень указанных групп без вторичный анализ требует больших затрат времени и стоимости. Однако как все кишки контент-анализ, такой анализ предоставляют только снимок кормления поведение. Таким образом сочетая молекулярной кишки содержание анализа с анализом времени интеграция естественных Трейсеры (например, стабильные изотопы) считается полезным^1,2.

Здесь мы описываем подробный метод для проведения расследований на основе ПЦР хищник жертва взаимодействий с использованием наборов группа специфического праймера для ядерных рибосомной ДНК (рДНК) регионов сочетаться с анализом стабильного изотопа же образца. Мы описываем обнаружение ДНК одного хищных групп через электрофорез геля агарозы. Кроме того мы представляем возможность для дальнейшего течению анализ продуктов ПЦР из таких групп специфические праймеры применимых всякий раз, когда требуется высокий таксономический разрешение чем специфика грунтовки. Потому что один мель ДНК (ssDNA) фрагменты формы третичного конформации, которые определяются их первичной последовательности¹⁷, небольшие вариации в фрагментах усиливаются такие группы специфические праймеры привести к конформационные изменения. Такие изменения могут быть обнаружены анализами полиморфизм (SSCP) конформации одиночной стренги полиакриламидных гелей^17,18, что позволяет более точное определение хищных организмов (вплоть до уровня видов).

В то время как электрофорез геля агарозы является общим и недорогой инструмент для визуализации фрагментов ДНК и определить их Приблизительная длина¹⁹резолюции зависит количество ДНК и окрашивание красителем используется²⁰. Обычно визуализация это прямо вперед, при работе с чистой образцов ДНК, но потенциально низкое количество хищных ДНК в кишечнике содержимое потребителей может осложнить скоринга результаты электрофореза геля агарозы. Тем не менее, этот метод обнаружения осуществима на экране низкое количество потребителей образцов из поля для одного или несколько охотятся группами, но осложнение в скоринга делает скрининг большое количество образцов для нескольких добычу таксонов чрезвычайно время интенсивных и таким образом неосуществимой. Более чувствительным методом обнаружения является автоматизированный анализ фрагментов через капиллярного электрофореза, который дополнительно позволяет определить точную длину фрагментов²¹. Несколько микроспутника на основе исследования показали, что с помощью различных флуоресцентных красителей как этикетки, это можно обнаружить и определить различные фрагменты сопоставимых длины путем автоматического фрагмента анализ^{22,23, 24}. Таким образом мы также представить подробный протокол для параллельных обнаружение ДНК из нескольких добычей групп с помощью ПЦР с метками группа специфического праймера наборы и обнаружения через анализ автоматизированной фрагмент с автоматизированной программы sequencer. Кроме того мы представляем результаты тематического исследования, показывающие, что обнаружение ДНК добычу через анализ автоматизированной фрагмент является подход, который позволяет также относительное количественная оценка попадает хищных.

Protocol

1. собирать мелководьях от области и подготовить образцы для анализа содержания генетических Gut. Мелководьях собрать на каждом сайте, разобраться особей видов потребительского интереса в одной пробирки и заморозить их непосредственно в жидкого азота или сухого льда для предотвр?…

Representative Results

Мы успешно использовать шаги, описанные в этом протоколе для диеты анализов в рамках различных исследований. В этом разделе мы представляем примеры, описывающие применимость различных разделов протокола. Как пример чтобы продемонстр?…

Discussion

Здесь мы представляем легко и экономически эффективным методом для определения на основе ПЦР хищник жертва взаимодействий от образцов поле через группу специфические праймеры для рДНК регионов, которые могут быть объединены с другими не молекулярный анализ образцов же. Однако есть н?…

Materials

liquid nitrogen	Any	NA	For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock	Any	NA	For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope	Any	NA	Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes	Any	NA	To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7	Bioform	B40d	This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5	Bioform	B40b	This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel	Any	NA
Lab scale	Any	NA	Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	Any	NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml	VWR	211-2165	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml	VWR	211-2164	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	carlroth	8043.1	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	carlroth	4360.1	For extraction of DNA
Proteinase K lyophil.	carlroth	7528.1	Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm	Quiagen	69989	For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	Any	NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a.	Any	NA
Water Molecular biology grade (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates	VWR Peqlab	732-2879	Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes	VWR Peqlab	732-3223	Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose	Peqlab	35-1020	Used for gel electrophoresis.
Microwave	Any	NA
Conical flask	Any	NA
Measuring cylinder	Any	NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth	Any	NA	For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002	Life Technologies	NA
Ethidium bromide solution 1 %	carlroth	2218.1	Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide	carlroth	6749.1	Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose	carlroth	4621.1	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system	Any	NA	To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate	carlroth	9592.2	For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	carlroth	23.67.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker	Any	NA
RC 10 Digital chiller	VWR	462-0138	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate	VWR	730-0261	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate	VWR	730-0260	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers	VWR	730-0262	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth	VWR	730-0294	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform	Any	NA	For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS)	AB Sciex	608082	For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate	Costar	6551	For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer	AB Sciex	608012	For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI	AB Sciex	608010	For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System	Beckman Coulter	NA	For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	To analyze results of automated fragment analyses.