Macroinvertebrates 사용 하 여 그룹별 수생 rDNA 뇌관의 유전 직감 콘텐츠 분석을 위한 실험실 프로토콜

Summary

Macroinvertebrates의 가장 일반적인 직감 콘텐츠 분석은 시각. 먹이 생물의 형태학 상 다양성에 대 한 강렬한 지식을 요구, 그들은 부드러운 바디 먹이 놓치지 고, 때문에 먹이의 강한 분쇄, amphipods를 포함 한 어떤 유기 체에 대 한 거의 불가능 하다. 우리는 macroinvertebrate에 대 한 자세한, 소설 유전 접근 먹이 amphipods의 식단에 식별을 제공 합니다.

Abstract

음식 웹 분석 생태계의 더 나은 이해를 위해 근본적 이다. 예를 들어 식품 웹 상호 작용 비 원주민 종족의 침공으로 인 한 심한 변화를 받을 수 있습니다. 그러나, 필드 약탈자 먹이 상호 작용의 정확한 식별 대부분의 경우에서 어렵습니다. 이러한 분석은 종종 본질적인 내용에 대 한 시각적 평가 또는 안정 동위 원소 비율 (δ¹⁵N 그리고 δ¹³C)의 분석 기반으로 합니다. 이러한 방법이 필요 포괄적인 지식에 대해, 각각, morphologic 다양성 또는 개별 먹이 생물, 먹이 생물의 정확한 식별에서 장애물을 선도에서 동위 원소 서명. 단식, 섭취 및 먹이 생물의 소화 어려울 특정 종의 식별 하기 때문에 비주얼 직감 콘텐츠 분석 특히 부드러운 바디 먹이 생물을 과소 평가. 따라서, 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 기반 전략, 예를 들어 그룹-특정 뇌관의 사용 설정, 식품 웹 상호 작용의 수사를 위한 강력한 도구를 제공 합니다. 여기, 우리가 핵 ribosomal deoxyribonucleic acid (rDNA)에 대 한 그룹-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 필드에서 macroinvertebrate 소비자의 본질적인 내용을 조사 하기 위해 상세한 프로토콜을 설명 합니다. DNA 수 (작은 taxa)의 경우 전체 표본에서 추출 하거나 표본 수집 분야에서의 본질적인 내용. 존재와 DNA의 기능 효율성 테스트 개인에서 직접 확인 될 필요가 보편적인 뇌관을 사용 하 여 DNA의 각 소 단위를 대상으로 설정. 우리는 또한 소비 먹이 후속 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석 polyacrylamide 젤을 사용 하 여 수정 되지 않은 그룹 특정 한 뇌관으로 PCR 통해 종 수준 추가 결합 결정 될 수 있다 보여줍니다. 또한, 우리는 레이블로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 자동된 조각 분석을 통해 여러 창 콘텐츠 샘플에서 다른 먹이 그룹의 DNA 파편에 대 한 병렬 심사 수 보여줍니다.

Introduction

약탈자 먹이 상호 작용, 영양 상호 작용 및 음식 웹 역동성의 대부분을 구성 하는 물질과 식품 웹 시간과 생태계 생태학의 주요 목표 중 하나는 사이 걸쳐 에너지의 플럭스 특성 주요 측면은 ¹. 소스 결정과 탄소와 영양소의 흐름 생태계²사이의 생태 연결의 이해 발전 이다. 그러나, 생태계, 강과 그들의 catchments 같은 생물³의 움직임에 의해 뿐만 아니라 유기 물질과 영양소의 용만 연결 되지 않습니다. 따라서, 그 시스템을 연결 하는 자원의 흐름을 방해 하는 서식 지 변경 변경할 수 있습니다 강력 하 게 두 생태계의 음식 웹 직접 뿐만 아니라 또한 간접적으로 포식 자-먹이 커뮤니티의 각각 구성 변경 하 여. 예를 들어, 음식 웹의 변화 한 포식 종 (예를 들어, 무지개 송어)⁴의 움직임에 연결 될 표시 되었습니다. 이러한 변화는 잠재적으로 생물 다양성 및 수생 생태계의 기능을 위협 한다. 따라서 필드에 약탈자 먹이 상호 작용 분석 인간 유발 환경 변화, 등 물 관리 관행, 수생 생태계의 네이티브 생물 다양성에 미치는 영향을 결정 필수적 이다.

영양 관계를 추적 하는 것은 어려운 복잡 한 시스템에서 이후 몇 가지 방법은 설립 되었습니다를 사용 하는 필드⁵에 있는 상호 작용을 먹이의 평가. 전통적으로, 조사 분야에서 상호 작용을 먹이 기의 해 부 용기에 먹이 남아의 시각적 식별에 기반 하 고 형태 론 적 먹이 다양성에 대 한 광범위 한 지식이 필요로. 비주얼 직감 콘텐츠 분석 소비자 (예: 계절 변화 다이어트에 랍스터⁶ 와 물고기^7,8 또는 먹이 환경 설정의 copepods의)의 여러 그룹의 리소스 사용에 대 한 통찰력을 제공 했다. 그러나, 소화의 물리적 과정 시각 직감 콘텐츠 분석 어려운 만들고 일반적으로 소프트 바디 먹이 유기 체⁹를 그리 워 합니다. 액체 섭취에 의해 먹이 종에 대 한 또는 집중적으로 그들의 음식 섭취, amphipods, 같은 전에 comminute 몇몇 무척 추 동물 소비자에 대 한 본질적인 내용에 먹이 종의 시각적 식별 불가능 한¹⁰입니다. 이러한 제한으로 인해 분자 분석 유망한 대안을 제공합니다.

분자 분석 이제 본질적인 내용에 신속 하 고 정확한 먹이 탐지를 허용 하는 일반적인 도구 되고있다. 이러한 기술의 범위는 다양 한: 단일 클론 항 체 또는 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR)에 근거를 둔 전략은, 때문에 자주 사용 그들의 높은 특이성 및 감도¹¹. 새로운 단일 클론 항 체의 개발은 시간 및 비용 집중, 그러므로, 다른 분자 기술에의 응용 프로그램은 더 유용 항 체¹¹를 이미 존재 하지 않는 경우. 또 다른 일반적인 접근은 보편적인 뇌관을 사용 하 여 대부분의 종에서 존재 ribosomal ribonucleic 산 (RNA) 유전자 처럼 deoxyribonucleic 산 (DNA)의 증폭 세트^12,13이다. 이 기술을 사용 하 여, 그것 불가능 자주 DNA¹⁴의 혼합된 소스 내에서 먹이 생물의 전체 범위를 식별 합니다. 이러한 단점을 피하기 위해 효과적인 접근 그룹 특정 뇌관을 사용 하 여 유전 직감 콘텐츠 분석에 대 한 설정입니다. 특정 대상 그룹의 DNA 영역만을 증폭 하 고 모든 다른 종^15,16제외 하도록 설계 된, 그룹 전용 프라이 머 사용 없이 지정된 된 그룹의 분류학 수준에 먹이 생물의 식별 시간 및 비용 집약적인 보조 분석입니다. 그러나, 모든 콘텐츠 분석 직감, 같은 같은 분석만 먹이 행동의 스냅샷을 제공 합니다. 따라서, 분석 시간 통합 자연 추적기 (예를 들어, 안정 동위 원소)의 분자 용기 콘텐츠 분석을 결합 하는 것은 유익한^1,2간주 됩니다.

여기, 약탈자 먹이 상호 작용 동일한 견본의 안정 동위 원소 분석 결합 될 핵 ribosomal DNA (rDNA) 지역에 대 한 그룹-특정 뇌관 세트를 사용 하 여 PCR 기반 조사에 대 한 자세한 방법을 설명 합니다. Agarose 젤 전기 이동 법을 통해 단일 먹이 그룹의 DNA의 탐지를 설명합니다. 또한, 선물이 해당 같은 그룹-특정 뇌관의 PCR 제품의 추가 다운스트림 분석 기회 뇌관 특이성 보다 높은 분류학 해상도 필요할 때마다. 때문에 단일 좌초 DNA (ssDNA) 양식 3 차 conformations 그들의 기본 시퀀스¹⁷에 의해 결정 되는 조각, 조각 같은 그룹-특정 뇌관에 의해 증폭에 작은 변화 구조적 변화에 이어질. 이러한 변화는 단일 가닥 구조 다형성 (SSCP) 분석 polyacrylamide 젤^17,18, 먹이 생물 (종 수준)의 더 정확한 id를 사용 하 여 검색할 수 있습니다.

Agarose 젤 전기 이동 법 DNA 파편을 시각화 하 고 그들의 대략적인 길이¹⁹, 해상도 결정 하는 일반적이 고 저렴 한 도구는 DNA의 금액에 따라 달라 집니다 및 착 색 염료 사용²⁰동안에. 일반적으로, 시각화는 곧장 앞으로 순수한 DNA 샘플을 작업할 때 하지만 잠재적으로 낮은 양의 먹이 소비자의 본질적인 내용에 DNA agarose 젤 전기 이동 법 결과의 점수 복잡 수 있습니다. 아직도,이 검색 메서드는 가능한 한 낮은 필드에서 소비자 표본 수를 화면 또는 몇 먹이 그룹, 하지만 점수에 합병증 샘플의 높은 숫자의 심사 여러 먹이 taxa 매우 시간이 집중 따라서 불가능. 더 민감한 검출 방법의 조각 조각²¹의 정확한 길이 결정 있습니다 모 세관 전기 이동 법을 통해 자동화 된 분석 이다. 여러 microsatellite 기반 연구 레이블로 다른 형광 성 염료를 사용 하 여 그것이 감지 하 여 자동된 조각 분석^{22,23에 의해 다른 파편의 유사한 길이 결정 24}. 따라서, 우리 또한 현재 여러 먹이에서 DNA의 병렬 검색에 대 한 자세한 프로토콜 레이블된 그룹-특정 뇌관 세트와 자동화 된 시퀀서와 자동된 조각 분석을 통해 감지 PCR를 사용 하 여 그룹. 또한, 우리는 자동된 조각 분석을 통해 먹이 DNA의 검출 방식은 또한 섭취 한 먹이의 상대 정량화를 가능 하 게 보여주는 사례 연구에서 결과 제시.

Protocol

1. 필드에서 Macroinvertebrates를 수집 하 고 유전자 직감 콘텐츠 분석에 대 한 샘플 준비. 각 사이트에서 수집 macroinvertebrates 개인 소비자 종의 단일 튜브에 대 한 관심의 밖으로 정렬 하 고 직접 액체 질소 나 드라이 아이스 용기 클리어런스 및 DNA의 저하를 방지 하기 위해 그들을 동결. 참고: 알콜, 샘플 저장 일부 macroinvertebrates 알콜 그들을 죽이기 전에 역류 하는 경향이 있기 때문에 피하…

Representative Results

우리는 성공적으로 다른 연구에서 다이어트 분석이 프로토콜에 설명 된 단계를 사용 합니다. 이 섹션에서 우리는 프로토콜의 다른 섹션의 적용을 설명 하는 예제를 제시. 예를 들어, 저자28 및 SSCP 분석에 의해 PCR 제품의 추가 다운스트림 분석의 잠재력에 의해 설립 하는 그룹-특정 뇌관 세트의 효과 설명 하는…

Discussion

여기, 우리는 동일한 견본의 다른 비 분자 분석 결합 될 수 있는 rDNA 지역에 대 한 그룹-특정 뇌관 통해 필드 샘플에서 약탈자 먹이 상호 작용의 PCR 기반 결정에 대 한 간단 하 고 비용 효율적인 방법 제시. 그러나, 몇 가지 중요 한 단계는 프로토콜 내에서 있다. 첫째, 사용 하는 뇌관의 특이성을 확보 필수적 이다. 둘째,는 위장의 준비 및 후속 DNA 추출 하는 동안 오염 및 창 자 콘텐츠 자료의 손실을 …

Materials

liquid nitrogen	Any	NA	For transport of field samples of macroinvertebrates to the laboratory.
1.5 ml reaction tubes – Safelock	Any	NA	For collection of consumer specimens in the field and subsequent conservation in liquid nitrogen reaction tubes do not necessarily need to be PCR clean. To avoid exploding of the tubes, the lid of the tubes should be punctured with a needle.
Stereomicroscope	Any	NA	Make sure magnification is suitable to prepare the gastro-intestinaltract of the size of consumer of interest.
Petri dishes	Any	NA	To dissect the gastro-intestinal tract of consumer specimens under the stereomikroscope.
Stainless steel foceps: Dumont forceps No. 7	Bioform	B40d	This curved stainless steel forceps can sometimes be very helful to hold specimen fixed inbetween the curved part without puncturing the gastro-intestinal tract.
Stainless steel foceps: Dumont forceps Electronic No. 5	Bioform	B40b	This fine stainless steel forceps is ideally suited for the preparation of the gastro-intestinal tract of consumer specimens.
DNA-ExitusPlus	AppliChem	A7409,1000RF	Decontamination solution for the removal of DNA and RNA contaminations
fuzz-free paper towel	Any	NA
Lab scale	Any	NA	Precision needs to be at least 0.01 g.
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	Any	NA
Safe-Lock Tubes 2.0 ml	VWR	211-2165	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Safe-Lock Tubes 1.5 ml	VWR	211-2164	It is crucial that these raction tubes are free of DNA, DNase, RNase and PCR inhibitors (PCR clean)!
Sodium chloride ≥99.5%, p.a., ACS, ISO	carlroth	3957.3	For salt extraction buffer (SEB) and 5M NaCl-solution required for extraction of DNA.
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Tris	carlroth	4855.2	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Microlitre pipettes (0.5-10/10-100/50-200/100-1000 μL)	carlroth	8043.1	For salt extraction buffer (SEB) and TBE buffer
Boric acid ≥99.8 %, p.a., ACS, ISO	carlroth	6943.2	For TBE buffer. Not needed if commercialy available TBE buffer is obtained.
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	carlroth	4360.1	For extraction of DNA
Proteinase K lyophil.	carlroth	7528.1	Prepare a working solution containing 10 mg/ml.
TissueLyser II	Quiagen	85300	Bead mill for homogenization of the samples.
Stainless Steel Beads, 5 mm	Quiagen	69989	For homogenization of samples.
Heating Thermoshaker	Any	NA
Vortex Mixer	Any	NA
Refrigerated centrifuge: himac CT 15 RE	Hitachi	NA	Refrigerated centrifuge used for centrifugation during the extraction of DNA (Protocol 1).
Isopropanol	carlroth	6752.5
Ethanol 99.8 %, p.a.	Any	NA
Water Molecular biology grade (ddH2O)	AppliChem	A7398,1000	nuclease-free (stream sterilized and DEPC treated) water used for re-suspension of DNA and whenever refered to ddH2O within the manuscript
Unmodified Olegonucleotides	Eurofins MWG Operon	NA	Primers unlabeled
Modified olegonucleotides	Metabion International AG	NA	Primers labelled
peqGOLD Taq all inclusive	VWR Peqlab	01-1000	Taq all inclusive for PCR reaction mixtures (reaction buffer Y and S, dNTPs and MgCl2)
Primus 96 advanced gradient thermocycler or peqStar96x Universal Gradient	Peqlab	NA	Primer sets were originally established on a Primus 96 advanced gradient thermocycler. As this cycler was quite old, we than checked if our primer sets are efficient and specific under the same conditions using the peqSta96x (which also could simulate the older model). However, tests showed that our primers work well and are still specific (see Koester et al. 2013) without using the simulation of the old machine.
Standard 96 Well PCR Plates	VWR Peqlab	732-2879	Used for PCR reactions.
Low Profile Tube Stripes 0.15 ml with Flat Cap Stripes	VWR Peqlab	732-3223	Cap stripes used to close the PCR plates.
Agarose	Peqlab	35-1020	Used for gel electrophoresis.
Microwave	Any	NA
Conical flask	Any	NA
Measuring cylinder	Any	NA
Horizontal electrophoresis unit and respective combs with teeth	Any	NA	For agarose gel electrophoresis.
Electrophoresis Power Supply PS3002	Life Technologies	NA
Ethidium bromide solution 1 %	carlroth	2218.1	Used to prepare staining bath for agarose gels.
Formamide	carlroth	6749.1	Needded for the denaturation buffer for SSCP analyses.
Bromphenol blue	AppliChem	A3640.0010	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
Sucrose	carlroth	4621.1	Needed for the loading dye for agarose gel electrophoresis.
100 bp-DNA-Ladder extended	carlroth	T835.1	As size standard for agarose gel electrophoresis.
UV-Documentation system	Any	NA	To visualize gel electrophoresis results.
Rotiphorese NF-Acrylamide/Bis-solution 40 % (29:1)	carlroth	A121.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Ammonium peroxydisulphate	carlroth	9592.2	For the preparation of polyacrylamid gels.
foldback clips (32 mm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
square-shaped plastic box (21 × 6.5 × 5 cm)	Any	NA	For the preparation of polyacrylamid gels.
Tetramethylethylenediamine (TEMED)	carlroth	23.67.1	For the preparation of polyacrylamid gels.
Beaker	Any	NA
RC 10 Digital chiller	VWR	462-0138	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Vertical electrophoresis unit P10DS (OWL Separation Systems)	VWR	700-2361	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Notched glass plate	VWR	730-0261	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Blank glass plate	VWR	730-0260	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Spacers	VWR	730-0262	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Comb with 25 teeth	VWR	730-0294	For SSCP analyses using polyacrylamide gel electrophoresis.
Shaking platform	Any	NA	For constant shaking of the staining bath.
GelStar Nucleic Acid Stain (Lonza Rockland, Inc.)	Biozym	850535 (50535)	For staining of polyacrylamide gels.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 400bp	AB Sciex	608098	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch B.
GenomeLab DNA Size Standard Kit 600bp	AB Sciex	608095	For automated fragment analyses. Size stanard for Batch A.
Sample Loading Solution (SLS)	AB Sciex	608082	For automated fragment analyses.
Sequenzing plate – 96 Well Polypropylene PCR Microplate	Costar	6551	For automated fragment analyses.
Plate centrifuge, PerfectSpin P	VWR Peqlab	NA	mini plate centrifuge used to spin down PCR products.
Buffer plate – 96 Well EIA/RIA Clear Flat Bottom Polystyrene Not Treated Microplate	Corning	9017	For automated fragment analyses.
GenomeLab Seperation buffer	AB Sciex	608012	For automated fragment analyses.
Separation Gel – LPAI	AB Sciex	608010	For automated fragment analyses.
Sequenzer – CEQ8000 Genetic Analysis System	Beckman Coulter	NA	For automated fragment analyses.
GeneMarker V1.95	Softgenetics	NA	To analyze results of automated fragment analyses.