Voorbereiding stappen voor meting van reactiviteit in muis retinale arteriolen Ex Vivo
Summary
Veel visie-bedreigende oogbeschadigingen en/of ziekten worden geassocieerd met disfunctionele retinale microvessels. De meting van de retinale arteriole reacties is daarom belangrijk om te onderzoeken van de onderliggende pathofysiologische mechanismen. Dit artikel beschrijft een gedetailleerd protocol voor muis retinale arteriole isolatie en voorbereiding te beoordelen van de effecten van vasoactieve stoffen op vasculaire diameter.
Abstract
Vasculaire insufficiëntie en wijzigingen in de normale netvlies perfusie behoren tot de belangrijkste factoren voor de pathogenese van diverse zicht-bedreigende oogbeschadigingen en/of ziekten, zoals diabetische retinopathie, hypertensieve retinopathie en eventueel glaucoom. Daarom, retinale microvasculaire voorbereidingen zijn cruciale instrumenten voor fysiologische en farmacologische studies af te bakenen van de onderliggende pathofysiologische mechanismen en ontwerp therapieën voor ziekten. Ondanks het ruime gebruik van Muismodellen in ophthalmic onderzoek zijn studies over retinale vasculaire reactiviteit schaars in deze soort. Een belangrijke reden voor dit verschil is de uitdagende isolatie procedures vanwege de geringe omvang van deze netvlies bloedvaten, oftewel ~ ≤ 30 µm in diameter van de luminal. Om te omzeilen het probleem van directe isolatie van deze netvlies microvessels voor functionele studies, opgericht wij een isolatie en voorbereiding techniek waarmee ex vivo studies van de retinale vasoactivity van de muis in de buurt van de fysiologische omstandigheden . Hoewel de huidige experimentele voorbereidingen specifiek naar de muis retinale arteriolen verwijzen zal, kan deze methodologie gemakkelijk worden gebruikt om te microvessels van ratten.
Introduction
Verstoringen in het netvlies perfusie zijn betrokken bij de pathogenese van verschillende oogbeschadigingen en/of ziekten, zoals diabetische retinopathie en hypertensieve retinopathie, glaucoom1,2,3. Dus, studies gericht op het meten van vasculaire reactiviteit in de retina zijn belangrijk om te begrijpen van de pathofysiologie van deze ziekten en voor de ontwikkeling van nieuwe behandeling benaderingen.
Als gevolg van de mogelijkheid van genetische manipulatie in de lymfkliertest genoom, is de muis een gebruikte diermodel voor studies over de cardiovasculaire systeem4geworden. Echter, vanwege de kleine omvang van retinale bloedvaten (≤ 30 µm), meting van vasculaire reactiviteit in de retina van de muis is uitdagend. Bijvoorbeeld, stereomicroscopic technieken voor in vivo meting zijn beperkt in hun optische resolutie en daarom alleen toestaan om precies de opsporing van wijzigingen in diameter of bloed stroom in kleine bloed van minder dan ≤ 30 µm diameter wanneer uitgerust met aanvullende geavanceerde apparaten, zoals een confocal microscoop met fluorescente kleurstoffen of de adaptieve optica Scanning licht oftalmoscoop5,6. Bovendien, de interpretatie van in vivo metingen gericht op het identificeren van lokale signalering mechanismen in netvlies bloedvaten kunnen worden verward door anesthesie, veranderingen in de systemische bloeddruk en de invloed van retrobulbaire bloedvaten.
Daarom ontwikkelden we een methode voor het meten van de reacties van het netvlies bloedvaten muis met hoge optische resolutie ex vivo. De hier vermelde techniek kunt visualisatie van retinale arteriolen via verzonden de lichte microscopie. Deze methode, die ook kan worden gebruikt bij ratten, biedt toegang tot de voordelen van gen targeting-technologie in oogbeschadigingen en/of vasculaire onderzoek.
Protocol
Representative Results
Discussion
De meting van vasculaire reacties in het netvlies van de muis is uitdagend wegens de kleine grootte van de retinale bloedvaten. Met de voorgestelde techniek, worden retinale arteriolen gevisualiseerd door doorvallend licht microscopie. Dit is mogelijk, omdat de geïsoleerde netvlies doorschijnend is. Het voordeel van de techniek is de hoge optische resolutie. De berekende ruimtelijke resolutie is 11 px/µm. De echte oplossing voor deze optische systeem dat gebruikmaakt van wit licht is echter tussen 200 en 300 nm, die wo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door subsidies van de Ernst und Berta Grimmke Stiftung en de Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (hond).
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
- Toda, N., Nakanishi-Toda, M. Nitric oxide: ocular blood flow, glaucoma, and diabetic retinopathy. Prog Retin Eye Res. 26 (3), 205-238 (2007).
- Schuster, A. K., Fischer, J. E., Vossmerbaeumer, C., Vossmerbaeumer, U. Optical coherence tomography-based retinal vessel analysis for the evaluation of hypertensive vasculopathy. Acta Ophthalmol. 93 (2), e148-e153 (2015).
- Cherecheanu, A. P., Garhofer, G., Schmidl, D., Werkmeister, R., Schmetterer, L. Ocular perfusion pressure and ocular blood flow in glaucoma. Curr Opin Pharmacol. 13 (1), 36-42 (2013).
- Faraci, F. M., Sigmund, C. D. Vascular biology in genetically altered mice : smaller vessels, bigger insight. Circ Res. 85 (12), 1214-1225 (1999).
- Kornfield, T. E., Newman, E. A. Measurement of Retinal Blood Flow Using Fluorescently Labeled Red Blood Cells. eNeuro. 2 (2), (2015).
- Guevara-Torres, A., Joseph, A., Schallek, J. B. Label free measurement of retinal blood cell flux, velocity, hematocrit and capillary width in the living mouse eye. Biomed Opt Express. 7 (10), 4229-4249 (2016).
- Schallek, J., Geng, Y., Nguyen, H., Williams, D. R. Morphology and topography of retinal pericytes in the living mouse retina using in vivo adaptive optics imaging and ex vivo characterization. Invest Ophthalmol Vis Sci. 54 (13), 8237-8250 (2013).
- Gericke, A., et al. Identification of the muscarinic acetylcholine receptor subtype mediating cholinergic vasodilation in murine retinal arterioles. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (10), 7479-7484 (2011).
- Gericke, A., et al. Functional role of alpha1-adrenoceptor subtypes in murine ophthalmic arteries. Invest Ophthalmol Vis Sci. 52 (7), 4795-4799 (2011).
- Bohmer, T., et al. The alpha(1)B -adrenoceptor subtype mediates adrenergic vasoconstriction in mouse retinal arterioles with damaged endothelium. Br J Pharmacol. 171 (16), 3858-3867 (2014).
