Étapes de préparation pour la mesure de la réactivité chez les souris des artérioles rétiniennes Ex Vivo
Summary
Plusieurs maladies oculaires vision sont associés à des microvaisseaux rétiniennes dysfonctionnels. La mesure des réponses de l’artériole rétinienne est donc importante d’étudier les mécanismes physiopathologiques sous-jacents. Cet article décrit un protocole détaillé pour souris arteriole rétinienne isolement et préparation pour évaluer les effets des substances vasoactives sur diamètre vasculaire.
Abstract
L’insuffisance vasculaire et des altérations perfusion rétinienne normale sont parmi les principaux facteurs de la pathogenèse de diverses vue oculaires maladies mortelles, telles que la rétinopathie diabétique, rétinopathie hypertensive et éventuellement le glaucome. Préparations microvasculaires rétiniennes sont donc des outils pivots pour les études physiologiques et pharmacologiques délimiter les mécanismes physiopathologiques sous-jacents et à la conception des thérapies pour les maladies. Malgré l’utilisation de modèles de souris dans la recherche ophtalmologique, études sur la réactivité vasculaire rétinienne sont rares chez cette espèce. Des principales raisons de cette divergence sont les procédures d’isolement difficile en raison de la petite taille de ces vaisseaux sanguins rétiniens, c’est-à-dire ~ ≤ 30 µm de diamètre luminal. Pour contourner le problème de l’isolement direct de ces microvaisseaux rétiniennes pour des études fonctionnelles, nous avons mis en place une technique d’isolation et de préparation qui permet des études ex vivo vasoactivité rétine de souris dans des conditions physiologiques près . Bien que la préparation expérimentale actuelle fera expressément référence à des artérioles rétiniennes de souris, cette méthode peut facilement servir à microvaisseaux des rats.
Introduction
Troubles de perfusion rétinienne ont été impliqués dans la pathogenèse des maladies oculaires diverses, telles que la rétinopathie diabétique, rétinopathie hypertensive et glaucome1,2,3. Ainsi, les études visant à mesurer la réactivité vasculaire de la rétine sont importantes pour comprendre la physiopathologie de ces maladies et pour développer de nouveaux traitements s’approche.
En raison de la possibilité de manipulation génétique dans le génome murin, la souris est devenu un modèle animal largement utilisé pour les études du système cardiovasculaire4. Toutefois, en raison de la petite taille des vaisseaux sanguins rétiniens (≤ 30 µm), mesure de la réactivité vasculaire dans la rétine de souris est un défi. Par exemple, des techniques pour la mesure in vivo sont limités dans leur résolution optique et par conséquent ne permettent de détecter exactement les changements de débit diamètre ou de sang dans le petit sang inférieure à ≤ 30 µm de diamètre lorsqu’il est équipé avec autres appareils sophistiqués, comme un microscope confocal à l’aide de colorants fluorescents ou l’Adaptive Optics balayage lumière ophtalmoscope5,6. En outre, l’interprétation de in vivo les mesures visant à identifier les mécanismes dans les vaisseaux sanguins rétiniens peuvent être confondus par les anesthésiques, de signalisation modifie la pression artérielle systémique et l’influence des vaisseaux sanguins rétrooculaire.
Par conséquent, nous avons développé une méthode pour mesurer les réponses des vaisseaux sanguins rétiniens de souris avec haute résolution optique ex vivo. La technique présentée ici permet de visualiser des artérioles rétiniennes via transmis en microscopie photonique. Cette méthode, qui peut également être utilisée chez les rats, permet d’accéder aux avantages de la technologie en recherche vasculaire oculaire de ciblage génique.
Protocol
Representative Results
Discussion
La mesure des réponses vasculaires de la rétine de souris est difficile en raison de la petite taille des vaisseaux sanguins rétiniens. Avec la technique présentée, artérioles rétiniennes sont visualisées par microscopie à lumière transmise. Cela est possible, parce que la rétine isolée est translucide. L’avantage de la technique est la résolution optique élevée. La résolution spatiale calculée est 11 px/µm. Cependant, la résolution réelle de ce système optique qui utilise la lumière blanche est e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Ernst und Berta Grimmke Stiftung et la Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (le chien).
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
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