Procedura di preparazione per la misura della reattività in Mouse arteriole retiniche Ex Vivo
Summary
Molte malattie oculare visione-minacciose sono associata con disfunzionali microvasi retinici. Pertanto, la misura delle risposte arteriola retinica è importante approfondire i meccanismi fisiopatologici sottostanti. Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per mouse arteriola retinica isolamento e la preparazione per valutare gli effetti di sostanze vasoattive il diametro vascolare.
Abstract
Insufficienza vascolare e alterazioni nel normale perfusione retinica sono tra i fattori più importanti per la patogenesi di varie malattie oculari avvistare-minaccioso, quali retinopatia diabetica, retinopatia ipertensiva ed eventualmente il glaucoma. Di conseguenza, retiniche microvascolari preparazioni sono strumenti cardine per studi fisiologici e farmacologici delineare i meccanismi fisiopatologici sottostanti e di progettazione terapie per le malattie. Nonostante l’ampio uso di modelli murini in Ricerca oftalmica, gli studi sulla reattività vascolare retinica sono scarsi in questa specie. Delle ragioni principali per questa discrepanza è le procedure di isolamento impegnativo a causa le piccole dimensioni di questi vasi sanguigni della retina, che è ~ ≤ 30 µm di diametro luminal. Per aggirare il problema di isolamento diretto di questi microvasi retinici per studi funzionali, abbiamo stabilito una tecnica di isolamento e la preparazione che permette studi ex vivo di vasoattività retinica del mouse in condizioni di quasi-fisiologiche . Anche se i preparati sperimentali presenti in particolare farà riferimento alle arteriole retiniche del mouse, questa metodologia prontamente può essere impiegata per microvasi dai ratti.
Introduction
Disturbi della perfusione retinica sono stati implicati nella patogenesi di varie malattie oculari, quali la retinopatia diabetica, retinopatia ipertensiva e glaucoma1,2,3. Così, gli studi volti a misurare la reattività vascolare della retina sono importanti per comprendere la fisiopatologia di queste malattie e per sviluppare il nuovo trattamento si avvicina.
Grazie alla possibilità di manipolazione del gene nel genoma murino, il mouse è diventato un modello animale ampiamente usato per gli studi del sistema cardiovascolare4. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni dei vasi sanguigni retinici (≤ 30 µm), misura della reattività vascolare nella retina di topo è complessa. Ad esempio, stereomicroscopia tecniche per la misurazione in vivo sono limitati nella loro risoluzione ottica e quindi solo consentono di rilevare esattamente i cambiamenti nel flusso di diametro o di sangue nel sangue piccolo inferiore a ≤ 30 µm di diametro quando equipaggiato con sofisticati dispositivi aggiuntivi, come un microscopio confocale utilizzando coloranti fluorescenti o l’ottica adattiva che scansione oftalmoscopio luce5,6. Inoltre, l’interpretazione di in vivo misure volte ad individuare locali segnalazione meccanismi in vasi sanguigni retinici possono essere confuse di anestetici, cambiamenti nella pressione arteriosa sistemica e l’influenza dei vasi sanguigni retrobulbar.
Di conseguenza, abbiamo sviluppato un metodo per misurare le risposte dei vasi sanguigni retinici del mouse con alta risoluzione ottica ex vivo. La tecnica qui presentata permette la visualizzazione delle arteriole retiniche tramite trasmissione microscopia chiara. Questo metodo, che può essere utilizzato anche in ratti, fornisce l’accesso ai vantaggi del gene targeting tecnologia nella ricerca vascolare oculare.
Protocol
Representative Results
Discussion
La misurazione delle risposte vascolari nella retina di topo è impegnativo a causa delle piccole dimensioni dei vasi sanguigni retinici. Con la tecnica presentata, arteriole retiniche sono visualizzate da microscopia chiara trasmessa. Questo è possibile, perché la retina isolata è traslucida. Il vantaggio della tecnica è l’alta risoluzione ottica. La risoluzione spaziale calcolata è 11 px/µm. Tuttavia, la risoluzione reale per questo sistema ottico che utilizza la luce bianca è fra 200 e 300 nm, che si spiega con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dall’Ernst und Berta Grimmke Stiftung e il Deutsche del Ophthalmologische Gesellschaft (cane).
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
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