마우스 망막 Arterioles Ex Vivo 에서 반응의 측정을 위한 준비 단계
Summary
많은 비전을 위협 눈 질병 장애 망막 microvessels와 연결 됩니다. 따라서, 망막 되 응답의 측정은 기본 병 태 생리 기계 장치를 조사 하는 것이 중요. 이 문서에서는 마우스 망막 되 격리와 혈관 직경에 vasoactive 물질의 효과 평가 하기 위해 준비에 대 한 상세한 프로토콜을 설명 합니다.
Abstract
혈관 불충분 그리고 정상 망막 관류 변경 다양 한 시력을 위협 하 고 안구 질환, 당뇨병 성 망막 증, 고혈압 성 망막 증 및 녹 내장 등의 병 인에 대 한 주요 요인 중입니다. 따라서 망막 microvascular 준비 중추적인 도구 기본 병 태 생리 기계 장치 윤곽을 그리 다 생리 및 약리 연구 및 질병에 대 한 치료를 디자인 하는. 안과 연구에 마우스 모델의 광범위 한 사용에도 불구 하 고 망막 혈관 반응성에 대 한 연구는이 종에서 부족. 이 불일치에 대 한 주요 이유는 도전적인 격리 절차는 이러한 망막 혈관의 작은 크기 때문 ~ luminal 직경에서 ≤ 30 µ m. 기능 연구에 대 한 이러한 망막 microvessels의 직접 분리의 문제를 회피, 우리 ex vivo 마우스 망막 vasoactivity 근처 생리 적 조건 하에서 연구를 가능 하 게 절연 및 준비 기술 설립 . 현재 실험 준비 특히 마우스 망막 arterioles를 참조 것입니다, 하지만이 방법은 쉽게 사용할 수 있습니다 microvessels에 쥐에서.
Introduction
망막 관류에 장애 당뇨병 성 망막 증, 고혈압 성 망막 증, 녹 내장1,2,3등 다양 한 안구 질환의 병 인에 연루 되었습니다. 따라서, 망막 혈관 반응성을 측정 하기 위한 연구는 이러한 질병의 병 태 생리학을 이해 하는 것이 중요 하 고 접근 새로운 치료를 개발 하.
Murine 게놈에서 유전자 조작의 가능성으로 인해 마우스4심장 혈관 시스템 연구에 대 한 널리 사용 되는 동물 모델 되고있다. 그러나, 망막 혈관 (≤ 30 µ m)의 작은 크기 때문에 측정 마우스 망막 혈관 반응성의 도전 이다. 예를 들어 stereomicroscopic vivo에서 측정을 위한 그들의 광학 해상도 제한 기술과 따라서 ≤ 30 µ m 직경 장비 될 때 보다는 더 적은의 작은 피에 지름 또는 혈액 흐름에 변화를 정확 하 게 탐지를 허용합니다 confocal 현미경 또는 적응 광학 스캔 빛 Ophthalmoscope5,6형광 염료를 사용 하 여 같은 추가 정교한 장치 합니다. 또한, 해석 vivo 측정 지역 식별 목적으로 조직 혈압과 retrobulbar 혈관의 영향 변화 신호 망막 혈관에서 메커니즘 마 취약에 의해 혼동 될 수 있습니다.
따라서, 우리는 ex vivo높은 광학 해상도와 마우스 망막 혈관의 반응을 측정 하는 방법을 개발 했다. 여기에 소개 하는 기술 망막 arterioles 통해 전송 가벼운 현미경 검사 법의 시각화 수 있습니다. 이 메서드를 사용할 수 있는 또한 쥐에, 안구 혈관 연구에서 기술을 대상으로 하는 유전자의 장점에 대 한 액세스를 제공 합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
마우스 망막에 혈관 반응의 측정은 망막 혈관의 작은 크기 때문에 도전 이다. 제시 기법으로 망막 arterioles 전송된 가벼운 현미경 검사 법에 의해 시각화 됩니다. 이 격리 된 망막은 반투명 하기 때문에 가능 하다. 기술의 장점은 높은 광학 해상도입니다. 계산된 공간 해상도 11 픽셀 / µ m 이다. 그러나, 하얀 빛을 사용 하 여이 광 시스템에 대 한 실제 해상도 Abbe 회절 한계에 의해 설명 된다 200, 300 nm …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 도이치 Ophthalmologische 분야 (개)와 에른스트 und Berta Grimmke 재단에서 교부 금에 의해 지원 되었다.
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
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