Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo
Summary
Muitas doenças oculares visão em risco estão associadas com microvessels da retina disfuncional. Portanto, a medição das respostas arteríola retinal é importante para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Este artigo descreve um protocolo detalhado para isolamento de rato arteríola retinal e preparação para avaliar os efeitos de substâncias vasoativas no diâmetro vascular.
Abstract
Insuficiência vascular e alterações na perfusão retiniana normal estão entre os fatores principais para a patogênese de várias doenças oculares visão em risco, tais como retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva e, possivelmente, glaucoma. Portanto, preparações microvasculares da retina são ferramentas cruciais para estudos fisiológicos e farmacológicos delinear os mecanismos fisiopatológicos subjacentes e a concepção terapias para as doenças. Apesar da ampla utilização de modelos de rato em pesquisa oftálmica, estudos sobre a reatividade vascular da retina são escassos nesta espécie. Das principais razões para esta discrepância é os desafiante procedimentos de isolamento devido ao tamanho pequeno destes vasos sanguíneos da retina, que é ~ ≤ 30 µm de diâmetro luminal. Para contornar o problema de isolamento direto destes microvessels da retina para estudos funcionais, estabelecemos uma técnica de isolamento e preparação que permite ex vivo estudos de vasoactivity da retina do rato sob condições fisiológicas perto . Embora as preparações experimentais presentes irão se referir especificamente as arteríolas retina do rato, esta metodologia prontamente pode ser empregada para microvessels de ratos.
Introduction
Distúrbios na perfusão da retina têm sido implicados na patogênese de várias doenças oculares, como retinopatia diabética, retinopatia hipertensiva e glaucoma1,2,3. Assim, estudos que visam medir a reatividade vascular na retina são importantes para compreender a fisiopatologia dessas doenças, e desenvolver novo tratamento se aproxima.
Devido à possibilidade de manipulação genética no genoma murino, o mouse tornou-se um modelo animal utilizado para estudos do sistema cardiovascular4. No entanto, por causa do pequeno tamanho dos vasos sanguíneos da retina (≤ 30 µm), medição de reatividade vascular na retina do rato é um desafio. Por exemplo, stereomicroscopic técnicas para a medição na vivo são limitadas em sua resolução óptica e, portanto, só permitem exatamente detectar alterações no fluxo de diâmetro ou sangue no sangue pequeno de menos de 30 µm de diâmetro ≤ quando equipado com dispositivos adicionais de sofisticados, tais como um microscópio confocal usando corantes fluorescentes ou a óptica adaptativa digitalização luz oftalmoscópio5,6. Além disso, a interpretação das medições na vivo vista identificar locais sinalização mecanismos nos vasos da retina podem ser confundidos por anestésicos, altera na pressão arterial sistêmica e a influência dos vasos sanguíneos de retrobulbar.
Portanto, nós desenvolvemos um método para medir respostas de rato dos vasos sanguíneos da retina com alta resolução óptica ex vivo. A técnica apresentada neste documento permite visualização das arteríolas retina através de transmitidas microscopia de luz. Esse método, que também pode ser usado em ratos, fornece acesso às vantagens do gene segmentação tecnologia na investigação vascular ocular.
Protocol
Representative Results
Discussion
A medição das respostas vasculares na retina do rato é um desafio devido ao pequeno tamanho de vasos da retina. Com a técnica apresentada, arteríolas retina são visualizadas por microscopia de luz transmitida. Isso é possível, porque a retina isolada é translúcida. A vantagem da técnica é a alta resolução óptica. A resolução espacial calculada é 11 px/µm. No entanto, a resolução real para este sistema óptico que utiliza a luz branca é entre 200 e 300 nm, que é explicado pelo limite de difração d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por concessões do und Ernst Berta Grimmke Stiftung e da Deutsche Ophthalmologische Gesellschaft (cão).
Materials
| Steel Scissors | Carl Roth GmbH | 3576.1 | 1x 140 mm |
| Eye Scissors | Geuder | G-19390 | 1x straight, 10.5 cm |
| Precision tweezers, straight with fine tips | Carl Roth GmbH | LH68.1 | 2x type 4 |
| Precision tweezers, straight with extra fine tips | Carl Roth GmbH | LH53.1 | 2x type 5 |
| Vannas capsulotomy scissors | Geuder | 19760 | 1x straight, 77 mm |
| Student Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 91501-09 | 1x curved, |
| Barraquer Needle Holder | Geuder | G-17500 | 1x curved, 120 mm |
| Needle | Becton, Dickinson and Company | 305128 | 1x 30 G |
| Glass Capillaries (for producing micropipettes) | Drummond Scientific Company | 9-000-1211 | 1x (1.2 x 0.8 mm; outer/inner diameter) |
| Nylon Suture | Alcon | 198001 | 1x 10-0 |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 153066 | 1x 35 mm diameter |
| Nunclon cell culture dish | Thermo Fisher Scientific | 172931 | 1x 100 mm diameter |
| Discofix C | Braun | 16500C | 10 cm |
| Histoacryl adhesive | B. Braun Surgical, S.A. | 1050052 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Pericyclic pump (CYCLO II) | Carl Roth GmbH | EP76.1 | 1x |
| Vertical Pipette Puller Model 700C | David Kopf Instruments | 1x | |
| Microscope (Vanox-T AH-2) | Olympus | 1x | |
| Water immersion objective LUMPlanFL, 1.0 NA | Olympus | 1x | |
| Digital camera (TK-C1381) | JVC | 1x | |
| Perfusion chamber | self-made | 1x | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Drugs and Solutions | |||
| Ethanol | Carl Roth GmbH | K928.4 | |
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2) | Carl Roth GmbH | 5239.1 | |
| Kalium chloride (KCl) | Carl Roth GmbH | 6781.1 | |
| Kalium dihydrogen phosphate (KH2PO4) | Carl Roth GmbH | 3904.2 | |
| Magnesium sulphate (MgSO4) | Carl Roth GmbH | 261.2 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth GmbH | 9265.2 | |
| Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) | Carl Roth GmbH | 0965.3 | |
| α-(D)-(+)- Glucose monohydrate | Carl Roth GmbH | 6780.1 | |
| 9,11-dideoxy-9α,11α-methanoepoxy prostaglandin F2α (U-46619) | Cayman Chemical | 16450 | |
| Acetylcholine chloride | Sigma-Aldrich | A6625-25G |
References
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