DNA-magnetische deeltjes analyse door dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing bindend

Summary

Dit protocol beschrijft de synthese van magnetische deeltjes en evaluatie van hun DNA-bindende eigenschappen via dynamische en elektroforetische lichtverstrooiing. Deze methode richt zich op het volgen van veranderingen in de grootte van de deeltjes, hun polydispersiteit en zeta potentieel van deeltje oppervlak die spelen belangrijke rol bij het binden van materialen zoals DNA.

Abstract

Isolatie van DNA met behulp van magnetische deeltjes is een gebied van groot belang in de biotechnologie en moleculaire biologie onderzoek. Dit protocol beschrijft de beoordeling van DNA-magnetische deeltjes bindend via Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en elektroforetische lichtverstrooiing (ELS). Analyse door DLS biedt waardevolle informatie over de fysisch-chemische eigenschappen van deeltjes met inbegrip van deeltjesgrootte, polydispersiteit en zeta potentiële. De laatstgenoemde beschrijft de oppervlakte lading van de deeltjes die hoofdrol in elektrostatische binding van materialen zoals DNA speelt. Hier is een vergelijkende analyse exploiteert drie chemische wijzigingen van nanodeeltjes en microdeeltjes en hun effecten op DNA-bindende en elutie. Chemische wijzigingen door vertakt polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate en (3-aminopropyl) triethoxysilane worden onderzocht. Aangezien DNA een negatieve lading vertoont, verwacht wordt dat de zeta potentieel van deeltje oppervlak op binding van DNA zal afnemen. Vorming van clusters, moet dit ook invloed op de deeltjesgrootte. Om te onderzoeken de efficiëntie van deze deeltjes in isolatie en de elutie van DNA, worden de deeltjes vermengd met DNA in lage pH (~ 6), hoge Ionische sterkte en uitdroging milieu. Deeltjes worden gewassen op magneet en DNA wordt dan uitgewassen door Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA exemplaaraantal is geschat aan de hand van kwantitatieve polymerase-kettingreactie (PCR). Zeta potentieel, deeltjesgrootte, polydispersiteit en kwantitatieve PCR-gegevens zijn geëvalueerd en vergeleken. DLS is een inzichtelijke en ondersteuning van de analysemethode waarmee u een nieuw perspectief aan het proces van screening van deeltjes voor DNA isolatie toevoegt.

Introduction

DNA isolatie is een van de meest essentiële stappen in moleculaire biologie. De ontwikkeling van nucleïnezuur extractiemethoden heeft grote impact op het opkomende gebied van de genomica, metagenomics en epigenetica transcriptomics. Er is een breed scala van biotechnologische toepassingen voor DNA isolatie met inbegrip van medische (forensische/diagnose tools en prognostische biomarkers) en milieu-toepassingen (metagenomic biodiversiteit, pathogen prevalentie en toezicht). Er is toenemende vraag om te zuiveren en isoleren van DNA van verschillende materialen en in verschillende schalen zoals bloed, urine, bodem, hout en andere soorten monsters. ^{1 , 2 , 3 , 4}

Nano – en micro-gerangschikte deeltjes zijn geschikt voor DNA isolatie vanwege hun hoge oppervlakte en in het bijzonder wanneer ze door een magnetisch veld kunnen worden geïmmobiliseerd. Fysisch-chemische eigenschappen van deeltjes, zoals het formaat of de lading, kunnen hun vermogen om te binden doel biomoleculen sterk beïnvloeden. ⁵ ter verdere versterking van de binding van biomoleculen en deeltjes stabiel te houden, kunnen er verschillende chemische wijzigingen (oppervlaktecoatings) worden gebruikt. De vele verschillende strategieën voor bindende worden ingedeeld covalent en niet-covalente interacties. ⁶ de grootte van de deeltjes rechtstreeks van invloed is op hun magnetisatie-eigenschappen, overwegende dat deeltje samenstelling kan worden aangepast door opneming van metalen, aluminium of andere materialen die invloed op de dichtheid, porositeit en oppervlak uitoefenen kunnen. ⁷ is er geen betrouwbare manier om te meten oppervlak last van kleine deeltjes. In plaats daarvan, de elektrische potentiaal op het desbetreffende vliegtuig (enige afstand van nanoparticle oppervlak) kan worden gemeten. ⁸ deze waarde heet zeta potentiële en het is een krachtig instrument dat gewoonlijk wordt gebruikt voor de evaluatie van nano- en microparticle stabiliteit via DLS. ⁹ omdat de waarde ervan sterk afhankelijk zijn niet alleen van de pH en de Ionische sterkte van de verspreide omgeving, maar ook over de oppervlakte kenmerken van de deeltjes is, het kan ook blijken de veranderingen in dit oppervlak veroorzaakt door de interactie tussen de deeltjes en molecule van belang. ¹⁰

Aan de andere kant, voorkomende DNA-structuur in gedehydrateerde voorwaarden (A-DNA formulier) exposities gecomprimeerde conformaties die haar neerslag (aggregatie vergemakkelijken) in vergelijking tot vaak B-DNA formulier. Elektrostatische (Ionische en H-binding) zijn de grote krachten die beheersing van de binding van DNA met andere materialen als gevolg van hun sterically toegankelijk fosfaat en stikstof (met name guanine) baseert. ^{7 , 10}

In dit werk, drie representatieve chemische wijzigingen van magnetische nanodeeltjes en microdeeltjes worden geanalyseerd (figuur 1A). De methode van synthese en chemische modificatie van nanodeeltjes en microdeeltjes wordt beschreven. Een bindoplossing, die akkoorden aan de theoretische principes van DNA neerslag (pH, Ionische sterkte en uitdroging), wordt gebruikt ter beoordeling van DNA-bindende en elutie. Kwantitatieve PCR wordt gebruikt ter beoordeling van de efficiëntie van de elutie van DNA van de representatieve nanodeeltjes en microdeeltjes (figuur 1B). Deeltjesgrootte, polydispersiteit index en zeta potentiële zijn belangrijke parameters die worden gebruikt voor het visualiseren van de fysisch-chemische veranderingen die op deeltje oppervlak (Figuur 1 c optreden). Het is belangrijk om te benadrukken op de chemische karakterisatie van magnetische deeltjes oppervlak. Hoewel deze stap buiten het bestek van dit protocol was, kunnen verschillende moderne technieken worden toegepast om na te gaan van de efficiëntie van chemische wijzigingen. ^{11 , 12 , 13 , 14} Fourier transform infrarood spectroscopie (FTIR) kan worden gebruikt voor het infraroodspectrum van deeltje oppervlak te evalueren en te vergelijken met het spectrum van gratis chemische modifiers. X-Ray photoelectron spectroscopy (XPS) is een andere techniek die kan worden gebruikt voor het identificeren van de elementaire samenstelling van materiële oppervlak. Andere elektrochemische, microscopische en spectroscopische methoden kunnen worden gebruikt de licht werpen op de kwaliteit van deeltje synthese. Dit werk markeert een nieuw perspectief te analyseren DNA-magnetische deeltjes interacties via DLS.

Protocol

1. magnetische nanodeeltjes synthese synthese van magnetische nanodeeltjes gestabiliseerd met citraat (MNPs) toevoegen 20 mmol van FeCl 3 ∙ 6 H 2 O (5.406 g) en 10 mmol van FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1.988 g) in 20 mL gedeoxygeneerd dubbel gedestilleerd water (ddd water). Roer verkregen oplossing krachtig in het bekerglas onder N 2 sfeer met behulp van een mechanische schudinrichting totdat een transparante oplossing wordt verkr…

Representative Results

Met behulp van het protocol beschreven hier voor chemische synthese en wijziging van magnetische deeltjes, werden zes magnetische deeltjes gesynthetiseerd en geanalyseerd voor het DNA binden. Een samenvatting van de analyse wordt weergegeven in tabel 1. Door vergelijking van de grootte van de deeltjes in water en in bindoplossing, is het duidelijk dat alle deeltjes in oplossing bindend door 2-22 plooien samengevoegd. Sommige deeltjes verder samengevoegd tot meer plooien i…

Discussion

In dit protocol werden de theoretische principes die DNA binding met magnetische deeltjes via zeta potentiële verklaren onder vraag. Het protocol beschrijft de synthese en de wijziging van magnetische nanodeeltjes en microdeeltjes. Methode voor de bereiding van DNA controle en bindende oplossing worden ook beschreven. Twee strategieën worden hier weergegeven voor screening van DNA-deeltjes interacties: kwantitatieve PCR en DLS benadert. DLS biedt drie indicatoren van fysisch-chemische veranderingen in deeltjes: deeltje…

Materials

Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	207926	Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	380024	Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8263	Magnetic particle synthesis
Acetone	Penta	10060-11000	Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	W302600	Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate	Sigma-Aldrich	131903	Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma-Aldrich	408727	Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228-M	Magnetic particle synthesis
Ethanol	Penta	71250-11000	Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate	Sigma-Aldrich	P6083	Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1.05012	Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)	Spectrum labs	G235063	Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer	witeg Labortechnik GmbH	DH.WOS01035	Magnetic particle synthesis
Waterbath	Memmert GmbH + Co.	84198998	Magnetic particle synthesis
Sonicator	Bandelin	795	Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759200-100EA	Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759240-100EA	Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell	Malvern	DTS1070	Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO NanoQuant instrument	Tecan	396 227 V1.0, 04-2010	device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit	Sigma-Aldrich	QR0100	PCR kit
Mastercycler pro S instrument	Eppendorf	6325 000.013	Thermocycler
MinElute kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S7670	DNA binding