ДНК-магнитопорошковый обязательного анализа динамических и электрофоретической рассеяние света
Summary
Этот протокол описывает синтез магнитных частиц и оценки их ДНК связывающих свойств через динамический и электрофоретической рассеяния света. Этот метод сосредоточена на мониторинге изменений в размер частиц, их полиизопрена и крупных Зета потенциал поверхности частиц, которые играют роль в привязке материалов, таких как ДНК.
Abstract
Изоляции ДНК, используя магнитные частицы — это поле большое значение в области биотехнологии и молекулярной биологии исследований. Этот протокол описывает оценки ДНК магнитные частицы, привязка через Динамическое рассеяние света (DLS) и электрофоретической рассеяния света (ПУЖ). Анализ DLS предоставляет ценную информацию о физико-химических свойств частиц, включая размер частиц, полиизопрена и Зета потенциал. Последний описывает поверхности заряд частицы, которая играет важную роль в электростатических привязки материалов, таких как ДНК. Здесь сравнительный анализ эксплуатирует три химической модификации наночастиц и микрочастиц и их влияния на привязки ДНК и элюции. Химические изменения, разветвленных polyethylenimine, исследованы тетраэтилсвинца (3-аминопропил) и orthosilicate triethoxysilane. Поскольку ДНК экспонатов отрицательный заряд, ожидается, что потенциал Зета поверхности частиц будет уменьшаться после связывания ДНК. Формирование кластеров следует также влияет на размер частиц. Для того, чтобы исследовать эффективность этих частиц в изоляции и элюции ДНК, частицы смешиваются с ДНК в низкий рН (~ 6), высокой ионной силы и обезвоживание среды. Частицы помыты на магнит и затем ДНК является этого eluted путем буфера Tris-HCl (рН = 8). Номер копии ДНК оценивается с помощью количественных полимеразной цепной реакции (ПЦР). Зета потенциал, размер частиц, полиизопрена и количественного PCR данные оцениваются и сопоставляются. DLS — глубокий и поддерживая метод анализа, который добавляет новую перспективу в процесс скрининга частиц для изоляции ДНК.
Introduction
ДНК изоляция является одним из наиболее важных шагов в области молекулярной биологии. Развитие методов извлечения нуклеиновой кислоты имеет большое влияние на новых полях геномики, метагеномики, epigenetics и transcriptomics. Существует широкий спектр биотехнологии для изоляции ДНК, включая медицинские (инструменты судебно-/ диагностические и прогностические biomarkers) и прикладных экологических исследований (метагеномных биоразнообразия, распространением возбудителя и наблюдения). Там было растущий спрос для очистки и изоляции ДНК из различных материалов и в различных масштабах, таких как крови, мочи, почвы, дерево и другие виды выборок. 1 , 2 , 3 , 4
Нано – и микро размера частицы подходят для изоляции ДНК из-за их высокой поверхности и особенно, когда они могут быть поставлены на прикол в с помощью магнитного поля. Физико-химических свойств частиц, таких как размер или заряд, может значительно влияние их способность связывания биомолекул целевой. 5 для дальнейшего расширения связывания биомолекул и стабилизации частиц, различные химические модификации (поверхность покрытия) может быть использован. Много различных стратегий для привязки классифицируются согласно ковалентных и non ковалентные взаимодействий. 6 размер частиц непосредственно влияет на их свойства намагниченности, а состав частиц может быть адаптирована путем включения металла, сплава или других материалов, которые могут влиять на его плотность, пористость и поверхности. 7 Существует нет надежного способа измерения поверхностного заряда мелких частиц. Вместо этого электрический потенциал на плоскости скольжения (на некотором расстоянии от поверхности наночастиц) может быть измерена. 8 это значение называется Зета потенциал и это мощный инструмент, который обычно используется для оценки нано – и тонкодисперсный стабильности через DLS. 9 поскольку ее значение зависит не только от рН и ионной силы дисперсионные окружающей среды, но и на характеристики поверхности частиц, он может также оказаться изменения в этой поверхности, вызванные взаимодействия между частицы и молекулы интерес. 10
С другой стороны структура ДНК в условия сушеный (форма A-ДНК) экспонатов уплотненного конформации, которые облегчают свое высыпание (агрегирование) по сравнению с обычно происходит формы B-ДНК. Электростатические (ионные и H-Бонд) основных сил, контролируя связывания ДНК с другими материалами благодаря их труднодоступных доступной фосфат и азота базы (особенно гуанином). 7 , 10
В этой работе, анализируются три представителя химической модификации магнитные наночастицы и микрочастиц (рис. 1A). Описан метод синтеза и химическая модификация наночастиц и микрочастиц. Решение, что придает теоретические принципы ДНК осадков (рН, ионной силы и обезвоживания), используется для оценки ДНК привязки и элюции. Количественная ПЦР используется для оценки эффективности элюции ДНК от представителя наночастиц и микрочастиц (Рисунок 1B). Размер частиц, индекс полиизопрена и Зета потенциальных являются важными параметрами, которые используются для визуализации физико-химические изменения, которые происходят на поверхности частиц (рис. 1 c). Важно подчеркнуть на химических характеристик поверхности магнитных частиц. Хотя этот шаг выходит за рамки настоящего Протокола, могут применяться несколько современных методов для изучения эффективности химической модификации. 11 , 12 , 13 , 14 инфракрасной спектроскопии преобразование Фурье (FTIR) может использоваться для оценки инфракрасный спектр частиц поверхности и сравнить его с спектр бесплатно химические модификаторы. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) является другой метод, который может использоваться для определения элементного состава материала поверхности. Другие электрохимические, микроскопические и спектроскопические методы может использоваться для пролить свет на качество частиц синтеза. Эта работа освещает новые перспективы для анализа ДНК магнитные взаимодействия частиц через DLS.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе теоретические принципы, которые объясняют ДНК привязки магнитные частицы через Зета потенциальных были под вопросом. Протокол описывает синтеза и модификации магнитные наночастицы и микрочастиц. Способ подготовки элемента управления и привязки решения ДНК также опи…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Финансовой поддержке CEITEC 2020 (LQ1601) и чешский научного фонда (проект GA CR 17-12816S) сильно признал.
Materials
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
References
- Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
- Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
- Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
- Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
- Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
- Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
- Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
- Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
- Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
- Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
- Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
- Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
- Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
