DNA Manyetik Parçacık dinamik ve elektroforetik ışık saçılma göre analiz bağlama
Summary
Bu iletişim kuralı manyetik parçacıklar sentezi ve değerlendirilmesi yolu ile dinamik ve elektroforetik ışık saçılma DNA’ya bağlanıcı özellikleri açıklar. Bu yöntem partikül büyüklüğü, onların polydispersity değişiklik izleme üzerinde odaklanır ve zeta potansiyeli oynamak parçacık yüzey Binbaşı bağlama DNA gibi malzemelerin rolü.
Abstract
Manyetik parçacıklar kullanarak DNA izolasyonu Biyoteknoloji ve Moleküler Biyoloji Araştırma yüksek öneme sahip bir alandır. Bu iletişim kuralı DNA-manyetik parçacıklar dinamik ışık saçılma (DL) ve elektroforetik ışık saçılma (ELS) bağlama değerlendirilmesi açıklar. DLS göre analiz partikül büyüklüğü, polydispersity ve zeta potansiyel gibi parçacıklar fizikokimyasal özellikleri üzerinde değerli bilgiler sağlar. İkinci DNA gibi malzemelerin Elektrostatik bağlamadaki önemli rol oynayan parçacık yüzey ücretten açıklar. Burada, karşılaştırmalı bir analiz nano tanecikleri ve microparticles ve DNA bağlama ve elüsyon üzerindeki etkileri üç kimyasal değişimleri patlatır. Dallı tarafından kimyasal değişimleri polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate ve (3-aminopropyl) triethoxysilane incelenmiştir. DNA negatif yük sergileyen beri zeta potansiyel parçacık yüzey üzerine DNA’ın bağlama azalır bekleniyor. Kümeleri oluşturan parçacık boyutu da etkiler. Bu parçacıklar izolasyon verimliliğini ve DNA’ın elüsyon araştırmak için parçacıklar düşük pH (~ 6), yüksek iyonik gücü ve dehidratasyon çevre DNA ile karıştırılır. Parçacıklar mıknatıs üzerinde yıkanmış ve sonra DNA Tris-HCl tampon tarafından eluted (pH = 8). DNA kopya sayısı nicel Polimeraz zincir tepkimesi (PCR) kullanarak tahmin ediliyor. Zeta potansiyeli, parçacık boyutu, polydispersity ve kantitatif PCR veri değerlendirilen ve karşılaştırıldığında. DLS bir anlayışlı ve parçacıklar DNA izolasyonu için tarama işlemi için yeni bir bakış açısı ekler analiz yöntemi destekleyen var.
Introduction
DNA izolasyon Moleküler biyolojide en önemli adımlardan biri. Nükleik asit ayıklama yöntem geliştirme genomik, metagenomics, epigenetik ve transcriptomics ortaya çıkan alanların büyük etkisi vardır. Çok çeşitli tıbbi dahil olmak üzere DNA izolasyonu (adli/tanılama araçları ve prognostik biyolojik) için Biyoteknolojik uygulamaları ve çevresel uygulamalar (metagenomic biyolojik çeşitlilik, patojen yaygınlık ve gözetim) vardır. Arındırmak ve farklı malzemelerden ve kan, idrar, toprak, tahta ve diğer tür örnekleri gibi farklı ölçeklerde DNA izole etmek için artan talep oluştu. 1 , 2 , 3 , 4
Ne zaman bir manyetik alan tarafından immobilize Nano ve mikro ölçekli parçacıklar için DNA izolasyonu yüksek onların yüzey alanı nedeniyle ve özellikle uygundur. Parçacıkların boyutu veya şarj, fizikokimyasal özellikleri hedef biomolecules şekilde bağlanabilemeleridir büyük ölçüde etkileyebilir. 5 farklı kimyasal değişimleri (yüzey kaplama) bağlama biomolecules, daha fazla arttırmak ve parçacıklar stabilize etmek için kullanılabilir. Birçok farklı stratejileri bağlama için kovalent ve kovalent olmayan etkileşimleri göre sınıflandırılır. 6 parçacık kompozisyon metalik, alaşım ve yoğunluğu, porozite ve yüzey üzerinde etkili olabileceği diğer maddeleri birleşme tarafından uygun olabilir, ancak parçacıkların boyutunu doğrudan mıknatıslanma özelliklerini etkiler. 7 küçük parçacıkların yüzey şarj ölçmek için güvenilir yolu yoktur. Bunun yerine, kayan uçak (nanopartikül yüzey uzak mesafe), Elektrik potansiyeli ölçülebilir. 8 bu değer zeta potansiyel denir ve genellikle DLS yolu ile nano – ve microparticle istikrar değerlendirilmesi için kullanılan güçlü bir araçtır. 9 değerini sadece pH ve iyonik gücü dağıtıcı çevre, aynı zamanda parçacıkların yüzey özellikleri üzerinde son derece bağımlı olduğundan, bu da arasındaki etkileşim nedeniyle bu yüzey değişiklikleri kanıtlayabilirim parçacıklar ve molekül ilgi. 10
Öte yandan, B-DNA formu onun yağış (toplama) ne zaman karşılaştırmak için yaygın olarak kolaylaştırmak susuz koşulları (A-DNA formu) sergiler sıkıştırılmış biçimler DNA yapısında meydana gelen. (Elektrostatik iyonik ve H-bond) DNA bağlama diğer malzemelere onların sterically erişilebilir fosfat nedeniyle kontrol büyük güçleri ve azot (özellikle guanin) temelleri. 7 , 10
Bu çalışmada, manyetik nano tanecikleri ve microparticles üç temsilcisi kimyasal değişimleri analiz edilir (şekil 1A). Nano tanecikleri ve microparticles kimyasal modifikasyonu ve sentez yöntemi açıklanmıştır. Bu anlaşmaları DNA bulutlu (pH, iyonik gücü ve dehidratasyon) teorik ilkeleri için bir bağlama çözüm DNA bağlama ve elüsyon değerlendirmek için kullanılır. Kantitatif PCR DNA elüsyon verimliliğini temsilcisi nano tanecikleri ve microparticles (şekil 1B) değerlendirmek için kullanılır. Partikül Büyüklüğü, polydispersity dizini ve zeta potansiyel (şekil 1 c) parçacık yüzeyinde oluşan fizikokimyasal değişiklikleri görselleştirmek için kullanılan önemli parametreleridir. Manyetik partikül yüzeyine kimyasal karakterizasyonu vurgulamak önemlidir. Bu adımı bu iletişim kuralının kapsamı dışında iken, kimyasal değişimleri verimliliğini araştırmak için çeşitli modern teknikler uygulanabilir. 11 , 12 , 13 , 14 Fourier transform Infrared spektroskopisi (FTIR) parçacık yüzey kızılötesi spektrum değerlendirmek ve ücretsiz kimyasal değiştiriciler spektrum karşılaştırmak için kullanılabilir. X-ışını photoelectron spektroskopisi (XPS) malzeme yüzeyi elemental kompozisyon tanımlamak için kullanılan bir tekniktir. Diğer elektrokimyasal, mikroskobik ve spektroskopik yöntemler parçacık sentez kalitesini ışık için kullanılabilir. DNA-Manyetik Parçacık etkileşimleri DLS yoluyla çözümlemek için yeni bir bakış açısı bu iş vurgulamaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol için zeta potansiyel ile manyetik parçacıklar DNA bağlanma açıklar teorik ilkeleri altında soru vardı. Protokol sentez ve manyetik nano tanecikleri ve microparticles değişiklik açıklar. DNA kontrolü ve bağlama çözüm hazırlanması için yöntemi ayrıca açıklanmıştır. İki strateji DNA-parçacık etkileşimleri ile taranması için burada gösterilir: kantitatif PCR ve DLS yaklaşıyor. DLS sağlar parçacıklar olarak fizikokimyasal değişiklikler üç göstergeleri: partikül büyükl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Çek Bilim Vakfı (proje GA CR 17-12816S) ve CEITEC 2020 (LQ1601) tarafından mali destek büyük ölçüde kabul edilmektedir.
Materials
| Iron(III) chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 207926 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) chloride tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 380024 | Magnetic particle synthesis |
| Iron(II) sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich | F8263 | Magnetic particle synthesis |
| Acetone | Penta | 10060-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Sodium citrate dihydrate | Sigma-Aldrich | W302600 | Magnetic particle synthesis |
| Tetraethyl orthosilicate | Sigma-Aldrich | 131903 | Magnetic particle synthesis |
| (3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma-Aldrich | 440140 | Magnetic particle synthesis |
| Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000 | Sigma-Aldrich | 408727 | Magnetic particle synthesis |
| Ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldrich | 221228-M | Magnetic particle synthesis |
| Ethanol | Penta | 71250-11000 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium nitrate | Sigma-Aldrich | P6083 | Magnetic particle synthesis |
| Potassium hydroxide | Sigma-Aldrich | 1.05012 | Magnetic particle synthesis |
| ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa) | Spectrum labs | G235063 | Magnetic particle synthesis |
| Overhead Stirrer | witeg Labortechnik GmbH | DH.WOS01035 | Magnetic particle synthesis |
| Waterbath | Memmert GmbH + Co. | 84198998 | Magnetic particle synthesis |
| Sonicator | Bandelin | 795 | Magnetic particle synthesis |
| BRAND UV cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759200-100EA | Cuvette for size measurement |
| BRAND cap for UV-cuvette micro | Sigma-Aldrich | BR759240-100EA | Cuvette caps for size measurement |
| Folded Capillary Zeta Cell | Malvern | DTS1070 | Cuvette for zeta potential measurement |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | Device for measurement of size and zeta potential |
| Infinite 200 PRO NanoQuant instrument |
Tecan | 396 227 V1.0, 04-2010 | device for measurement of DNA concentration |
| SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit | Sigma-Aldrich | QR0100 | PCR kit |
| Mastercycler pro S instrument | Eppendorf | 6325 000.013 | Thermocycler |
| MinElute kit | Qiagen | 28004 | DNA purification kit |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S7670 | DNA binding |
References
- Kulinski, M. D., et al. Sample preparation module for bacterial lysis and isolation of DNA from human urine. Biomed Microdevices. 11 (3), 671-678 (2009).
- Loonen, A. J. M., et al. Comparison of Pathogen DNA Isolation Methods from Large Volumes of Whole Blood to Improve Molecular Diagnosis of Bloodstream Infections. PloS One. 8 (8), (2013).
- Mahmoudi, N., Slater, G. F., Fulthorpe, R. R. Comparison of commercial DNA extraction kits for isolation and purification of bacterial and eukaryotic DNA from PAH-contaminated soils. Can J Microbiol. 57 (8), 623-628 (2011).
- Rachmayanti, Y., Leinemann, L., Gailing, O., Finkeldey, R. DNA from processed and unprocessed wood: Factors influencing the isolation success. Forensic Sci Int Genet. 3 (3), 185-192 (2009).
- Munir, M. T., Umar, S., Shahzad, K. A., Shah, M. A. Potential of Magnetic Nanoparticles for Hepatitis B Virus Detection. J Nanosci Nanotechnol. 16 (12), 12112-12123 (2016).
- Ulbrich, K., et al. Targeted drug delivery with polymers and magnetic nanoparticles: covalent and noncovalent approaches, release control, and clinical studies. Chem Rev. 116 (9), 5338-5431 (2016).
- Pershina, A. G., Sazonov, A. E., Filimonov, V. D. Magnetic nanoparticles-DNA interactions: design and applications of nanobiohybrid systems. Rus Chem Rev. 83 (4), 299 (2014).
- Xu, R. L. Progress in nanoparticles characterization: Sizing and zeta potential measurement. Particuol. 6 (2), 112-115 (2008).
- Krickl, S., Touraud, D., Kunz, W. Investigation of ethanolamine stabilized natural rubber latex from Taraxacum kok-saghyz and from Hevea brasiliensis using zeta-potential and dynamic light scattering measurements. Ind Crops Prod. 103, 169-174 (2017).
- Haddad, Y., et al. The Isolation of DNA by Polycharged Magnetic Particles: An Analysis of the Interaction by Zeta Potential and Particle Size. Int J Mol Sci. 17 (4), (2016).
- Tenorio-Neto, E. T., et al. Submicron magnetic core conducting polypyrrole polymer shell: Preparation and characterization. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 61, 688-694 (2016).
- Baharvand, H. Encapsulation of ferromagnetic iron oxide particles by polyester resin. e-Polym. 8 (1), 1-9 (2008).
- Ghorbani, Z., Baharvand, H., Nezhati, M. N., Panahi, H. A. Magnetic polymer particles modified with beta-cyclodextrin. J Polym Res. 20 (7), (2013).
- Heger, Z., et al. Paramagnetic Nanoparticles as a Platform for FRET-Based Sarcosine Picomolar Detection. Sci Rep. 5, (2015).
- Navarro, E., Serrano-Heras, G., Castaño, M. J., Solera, J. Real-time PCR detection chemistry. Clin Chim Acta. 439, 231-250 (2015).
