DNA-magnetoscopico associazione analisi di dispersione della luce dinamica ed elettroforetica

Summary

Questo protocollo descrive la sintesi delle particelle magnetiche e valutazione delle loro proprietà di legame al DNA tramite dispersione della luce dinamica ed elettroforetica. Questo metodo si concentra sul monitoraggio dei cambiamenti nella dimensione delle particelle, loro polidispersità e potenziale zeta della superficie delle particelle che svolgono importanti ruolo nell’associazione di materiali come il DNA.

Abstract

Isolamento di DNA usando particelle magnetiche è un campo di grande importanza nella ricerca di biologia molecolare e biotecnologia. Questo protocollo descrive la valutazione del DNA-magnetoscopico vincolante tramite diffusione dinamica della luce (DLS) e dispersione della luce elettroforetica (ELS). Analisi di DLS fornisce preziose informazioni sulle proprietà fisico-chimiche delle particelle tra cui la dimensione delle particelle, polidispersità e potenziale zeta. Quest’ultimo descrive la carica superficiale della particella che svolge un ruolo importante nell’associazione elettrostatica di materiali come il DNA. Qui, un’analisi comparativa sfrutta tre modifiche chimiche di nanoparticelle e microparticelle e loro effetti sul legame del DNA e di eluizione. Modificazioni chimiche di ramificata polyethylenimine, tetraetile ortosilicato e (3-amminopropil) trietossisilano sono studiati. Poiché DNA esibisce una carica negativa, si prevede che il potenziale zeta della superficie della particella diminuirà legandosi di DNA. Formando dei cluster dovrebbe essere estesa anche dimensione delle particelle. Al fine di indagare l’efficacia di queste particelle in isolamento ed eluizione del DNA, le particelle sono mescolate con DNA a basso pH (~ 6), alta forza ionica e ambiente di disidratazione. Le particelle vengono lavate il magnete e quindi il DNA è eluito dal tampone Tris-HCl (pH = 8). Numero di copie di DNA è stimato usando reazione a catena quantitativa della polimerasi (PCR). Potenziale Zeta, dimensione delle particelle, polidispersità e dati quantitativi di PCR sono valutati e confrontati. DLS è un perspicace e sostenere il metodo di analisi che aggiunge una nuova prospettiva al processo di proiezione di particelle per isolamento del DNA.

Introduction

Isolamento del DNA è uno dei passi più importanti nella biologia molecolare. Lo sviluppo di metodi di estrazione dell’acido nucleico ha grande impatto sui campi emergenti della genomica, metagenomica, epigenetica e trascrittomica. C’è una vasta gamma di applicazioni biotecnologiche per isolamento del DNA compreso medico (strumenti forensi/diagnostica e biomarcatori prognostici) e applicazioni ambientali (biodiversità metagenomica, la prevalenza del patogeno e sorveglianza). C’è stata la crescente domanda di purificare e isolare il DNA da materiali diversi e in diverse scale come sangue, urina, terra, legno e altri tipi di campioni. ^{1 , 2 , 3 , 4}

Particelle di nano – e micro-imprese sono adatte per isolamento del DNA a causa della loro elevata area superficiale e in particolare quando essi possono essere immobilizzati da un campo magnetico. Proprietà fisico-chimiche delle particelle, ad esempio dimensioni o carica, può notevolmente influenzare la loro capacità di legare biomolecole di destinazione. ⁵ per migliorare ulteriormente l’associazione di biomolecole e stabilizzare le particelle, diverse modificazioni chimiche (rivestimenti superficiali) possono essere utilizzati. Le diverse strategie per l’associazione sono classificate secondo le interazioni covalenti e non covalenti. ⁶ la dimensione delle particelle influenza direttamente la loro proprietà di magnetizzazione, considerando che la composizione delle particelle può essere adattato per incorporazione di metallico, lega o altri materiali che possono influire sulla sua densità, porosità e superficie. ⁷ non c’è alcun modo affidabile per misurare la carica superficiale di piccole particelle. Invece, il potenziale elettrico piano di scivolamento (certa distanza dalla superficie delle nanoparticelle) può essere misurata. ⁸ questo valore è chiamato potenziale zeta ed è un potente strumento che solitamente utilizzato per la valutazione della stabilità di nano e microparticelle tramite liste di distribuzione. ⁹ poiché il suo valore dipende non solo il pH e forza ionica dell’ambiente dispersivo, ma anche le caratteristiche della superficie delle particelle, può anche dimostrare i cambiamenti in questa superficie causata dall’interazione tra la particelle e molecola di interesse. ¹⁰

D’altra parte, la struttura del DNA in condizioni disidratate (modulo A-DNA) esposizioni compattato conformazioni che facilitano la relativa precipitazione (aggregazione) rispetto a comunemente che si verificano forma B-DNA. Elettrostatica (ionico e H-bond) sono le principali forze che controllano l’associazione del DNA da altri materiali a causa di loro fosfato stericamente accessibile e azoto basi (in particolare guanina). ^{7 , 10}

In questo lavoro, sono analizzate tre modifiche chimiche rappresentative di nanoparticelle magnetiche e microparticelle (Figura 1A). Il metodo di sintesi e modificazione chimica di nanoparticelle e microparticelle è descritto. Una soluzione di associazione, che accordi ai principi teorici di precipitazione del DNA (pH, forza ionica e disidratazione), viene utilizzata per valutare l’eluizione e grippaggio del DNA. PCR quantitativa viene utilizzata per valutare l’efficienza di eluizione del DNA dalla rappresentante nanoparticelle e microparticelle (Figura 1B). Dimensione delle particelle, l’indice di polidispersione e potenziale zeta sono parametri importanti che vengono utilizzati per visualizzare le modifiche fisico-chimiche che si verificano sulla superficie della particella (Figura 1). È importante sottolineare la caratterizzazione chimica della superficie della particella magnetica. Mentre questo passaggio era oltre l’ambito del presente protocollo, diverse moderne tecniche possono essere applicate per studiare l’efficienza delle modificazioni chimiche. ^{11 , 12 , 13 , 14} spettroscopia infrarossa trasformata di Fourier (FTIR) può essere utilizzata per valutare lo spettro infrarosso della superficie della particella e confrontarlo con lo spettro dei modificatori chimici gratis. Spettroscopia fotoelettronica a raggi x (XPS) è un’altra tecnica che può essere utilizzata per identificare la composizione elementare della superficie del materiale. Altri metodi elettrochimici, microscopiche e spettroscopiche utilizzabile per far luce sulla qualità della sintesi delle particelle. Questo lavoro evidenzia una nuova prospettiva per l’analisi di interazioni DNA-magnetiche di particelle tramite liste di distribuzione.

Protocol

1. sintesi di nanoparticelle magnetiche sintesi di nanoparticelle magnetiche stabilizzato con citrato (MNPs) aggiungere 20 mmol di FeCl 3 ∙ 6 H 2 O (5,406 g) e 10 mmol di FeCl 2 ∙ 4 H 2 O (1,988 g) in 20 mL di acqua distillata doppia deossigenata (ddd acqua). Mescolare ottenuti soluzione vigorosamente in Becher sotto atmosfera di 2 N tramite agitatore meccanico fino ad ottenuta una soluzione trasparente. Sott…

Representative Results

Mediante il protocollo descritto qui per sintesi chimica e la modifica delle particelle magnetiche, sei particelle magnetiche sono state sintetizzate e analizzate per il grippaggio del DNA. Una sintesi dell’analisi è mostrata nella tabella 1. Confrontando le dimensioni delle particelle in acqua e in soluzione di rilegatura, è chiaro che tutte le particelle aggregate in associazione soluzione da pieghe 2-22. Alcune particelle aggregate ulteriormente a più pieghe in pres…

Discussion

In questo protocollo, i principi teorici che spiegano il legame al DNA di particelle magnetiche via potenziale zeta erano sotto la domanda. Il protocollo descrive la sintesi e la modifica di nanoparticelle magnetiche e microparticelle. Metodo per la preparazione della soluzione di controllo e l’associazione del DNA inoltre sono descritti. Due strategie sono mostrate qui per lo screening delle interazioni DNA-particella: PCR quantitativa e liste di distribuzione si avvicina. DLS fornisce tre indicatori di cambiamenti fisi…

Materials

Iron(III) chloride hexahydrate	Sigma-Aldrich	207926	Magnetic particle synthesis
Iron(II) chloride tetrahydrate	Sigma-Aldrich	380024	Magnetic particle synthesis
Iron(II) sulfate heptahydrate	Sigma-Aldrich	F8263	Magnetic particle synthesis
Acetone	Penta	10060-11000	Magnetic particle synthesis
Sodium citrate dihydrate	Sigma-Aldrich	W302600	Magnetic particle synthesis
Tetraethyl orthosilicate	Sigma-Aldrich	131903	Magnetic particle synthesis
(3-Aminopropyl)triethoxysilane	Sigma-Aldrich	440140	Magnetic particle synthesis
Polyethylenimine, branched, average Mw ~25,000	Sigma-Aldrich	408727	Magnetic particle synthesis
Ammonium hydroxide solution	Sigma-Aldrich	221228-M	Magnetic particle synthesis
Ethanol	Penta	71250-11000	Magnetic particle synthesis
Potassium nitrate	Sigma-Aldrich	P6083	Magnetic particle synthesis
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	1.05012	Magnetic particle synthesis
ow-molecular-weight cut-off membrane (Mw=1 kDa)	Spectrum labs	G235063	Magnetic particle synthesis
Overhead Stirrer	witeg Labortechnik GmbH	DH.WOS01035	Magnetic particle synthesis
Waterbath	Memmert GmbH + Co.	84198998	Magnetic particle synthesis
Sonicator	Bandelin	795	Magnetic particle synthesis
BRAND UV cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759200-100EA	Cuvette for size measurement
BRAND cap for UV-cuvette micro	Sigma-Aldrich	BR759240-100EA	Cuvette caps for size measurement
Folded Capillary Zeta Cell	Malvern	DTS1070	Cuvette for zeta potential measurement
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	Device for measurement of size and zeta potential
Infinite 200 PRO NanoQuant instrument	Tecan	396 227 V1.0, 04-2010	device for measurement of DNA concentration
SYBR Green Quantitative RT-PCR Kit	Sigma-Aldrich	QR0100	PCR kit
Mastercycler pro S instrument	Eppendorf	6325 000.013	Thermocycler
MinElute kit	Qiagen	28004	DNA purification kit
Sodium acetate	Sigma-Aldrich	S7670	DNA binding